生物化学与分子生物学实验技术PDF电子书下载

第1章 分光光度技术 1

第一节 基本原理 1

一、光的基本知识 1

二、朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律 2

第二节 分光光度计结构简介 3

一、光源 3

二、分光系统（单色器） 4

三、狭缝 4

四、比色杯 4

五、检测器系统 4

第三节 分光光度技术的应用 5

一、测定溶液中物质的含量 5

二、用紫外光谱鉴定化合物 5

第四节 分光光度法的误差 6

第五节 常见国产分光光度计的使用 6

一、721型分光光度计 6

二、751型分光光度计 7

三、使用分光光度计的注意事项 8

思考题 9

参考文献 9

第2章 液相色谱技术 10

第一节 色谱原理及基本装置 11

一、色谱的基本理论 11

二、柱色谱的基本装置及基本操作 13

第二节 凝胶色谱 14

一、凝胶过滤的原理 14

二、相关概念和基本参数 15

三、凝胶的分类 16

四、凝胶色谱的操作 19

五、凝胶色谱的应用 21

第三节 离子交换色谱 22

一、基本原理 22

二、离子交换剂的类型及性质 23

三、离子交换剂的选择 25

四、离子交换色谱的操作要点 25

五、离子交换色谱的应用 27

第四节 亲和色谱 27

一、亲和色谱的基本原理 27

二、亲和吸附剂 28

三、亲和色谱的基本操作 29

四、亲和色谱的应用 30

第五节 高效液相色谱 31

一、高效液相色谱基本原理及特点 31

二、高效液相色谱流程及设备 32

三、高效液相色谱技术的分类与应用 33

四、快速蛋白液相色谱（FPLC） 34

思考题 35

参考文献 35

第3章 电泳技术 36

第一节 基本原理 37

第二节 影响电泳的因素 38

一、溶液的pH 38

二、溶液的离子强度 38

三、电场强度 38

四、电渗现象 39

五、支持介质的筛孔 39

第三节 电泳的种类和应用 39

一、醋酸纤维薄膜电泳 39

二、琼脂糖凝胶电泳 40

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 41

四、等电聚焦 45

五、毛细管电泳 45

六、双向电泳 46

七、变性梯度凝胶电泳 48

第四节 电泳后大分子的检测 49

一、染色显示法 49

二、微量光密度计测定法 51

思考题 51

参考文献 51

第4章 离心技术 52

第一节 离心作用的基本原理 52

一、离心力 52

二、相对离心力 52

三、沉降速度 53

四、沉降系数 53

五、沉降时间 54

六、K系数 54

第二节 离心机的类型 54

一、制备型离心机 54

二、分析型离心机 55

第三节 制备型超速离心的分离方法 56

一、差速沉降离心法 56

二、密度梯度区带离心法 56

第四节 离心机使用原则及注意事项 58

思考题 59

参考文献 59

第5章 荧光分析技术 60

第一节 荧光的基本知识 60

一、荧光的发光原理 60

二、荧光色素的性质 60

三、荧光的淬灭及抗淬灭 62

四、常用的荧光染料（探针） 62

第二节 免疫荧光细胞化学和荧光原位杂交技术 64

一、免疫荧光细胞化学技术 64

二、荧光原位杂交 65

三、荧光显微镜 66

第三节 流式细胞术 67

一、流式细胞仪的基本结构和工作原理 67

二、流式细胞术的应用 68

第四节 实时荧光定量PCR技术 69

一、荧光定量化学原理 69

二、荧光定量PCR仪的光学原理 70

三、荧光定量原理 70

四、样品制备及操作 71

五、主要用途 72

思考题 72

参考文献 73

第6章 蛋白质分离与制备技术 74

第一节 概述 74

第二节 选择材料及预处理 75

第三节 细胞的破碎及细胞器的分离 75

一、细胞的破碎 75

二、细胞器的分离 76

第四节 蛋白质的提取、分离与纯化 77

一、蛋白质（包括酶）的提取 77

二、蛋白质的分离与纯化 78

第五节 蛋白质定量及纯度分析 84

一、蛋白质定量 84

二、蛋白质纯度鉴定 86

第六节 蛋白质相对分子质量测定 87

一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 87

二、凝胶过滤法测定蛋白质的相对分子质量 87

三、沉降法（超速离心法） 87

第七节 蛋白质的浓缩、干燥及贮存 88

一、样品的浓缩 88

二、干燥 89

三、贮存 89

思考题 90

参考文献 90

第7章 DNA重组技术 91

第一节 核酸的提取 92

一、DNA的提取 92

二、RNA的提取 92

三、核酸的纯化 92

四、核酸的浓缩 93

五、核酸定量及纯度分析 93

第二节 目的基因的获取 93

一、直接从染色体中分离 93

二、化学合成法 93

三、RT-PCR 93

四、构建基因组文库及cDNA文库 94

五、聚合酶链反应 94

第三节 分子克隆载体与宿主细胞的选择 94

一、质粒 95

二、噬菌体 95

三、噬菌粒 96

四、黏粒 97

五、DNA病毒载体SV40 97

六、反转录病毒载体 97

七、宿主细胞 98

第四节 分子克隆常用的工具酶 98

一、限制性核酸内切酶 99

二、DNA聚合酶 99

三、DNA连接酶 100

四、末端脱氧核苷酸转移酶 100

五、核酸酶 100

六、脱氧核糖核酸酶 100

七、碱性磷酸酶 100

第五节 限制性内切酶对DNA的酶切及片段回收 100

一、限制性内切酶的选择 101

二、限制性内切酶的酶切 101

三、琼脂糖凝胶电泳分离和DNA片段的回收 102

四、琼脂糖凝胶中回收DNA片段的纯化 103

第六节 外源基因与载体的连接 103

第七节 重组DNA导入宿主细胞 104

一、大肠杆菌的转化 104

二、电脉冲穿孔法转化大肠杆菌 105

第八节 含重组质粒的宿主菌落的筛选与鉴定 105

一、利用宿主细胞遗传表型的改变进行筛选 105

二、根据重组子分子结构特性进行鉴定 106

思考题 107

参考文献 107

第8章 重组DNA的表达技术 108

第一节 大肠杆菌表达系统 108

一、大肠杆菌表达载体的构成 108

二、常用的大肠杆菌表达载体 110

三、在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略 115

四、表达产物的检测 116

五、原核表达系统的优缺点 116

第二节 真核细胞表达系统 118

一、哺乳动物细胞表达载体 118

二、哺乳动物细胞的基因导入 123

三、表达产物的鉴定 124

四、其他真核表达系统 124

思考题 124

参考文献 125

第9章 核酸杂交技术 126

第一节 核酸杂交的基本理论 126

一、DNA变性 126

二、DNA复性 127

三、核酸分子杂交 127

第二节 核酸探针及其标记 128

一、核酸探针的种类及应用 128

二、标记物的应用及选择 129

第三节核酸探针的标记方法 131

一、缺口平移法 131

二、随机引物法 131

三、用T4多核苷酸激酶标记DNA5′末端 131

四、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段快速标记DNA探针末端 132

五、非放射性物质标记核酸 132

第四节 核酸分子杂交方法 134

一、核酸分子杂交的类型 134

二、核酸分子杂交实验因素的优化 138

第五节DNA芯片技术 141

思考题 142

参考文献 143

第10章 聚合酶链反应技术 144

第一节 PCR技术基本原理、特点及影响因素 144

一、PCR技术的基本原理 144

二、PCR技术的基本特点 144

三、影响PCR反应的因素 146

第二节 PCR的基本步骤 147

第三节 PCR反应条件的优化 148

一、PCR反应条件的常规优化方法 148

二、降落PCR 149

第四节 PCR引物设计 149

一、PCR引物设计的基本原则 149

二、引物设计软件 150

第五节 反转录PCR技术 150

一、反转录PCR技术的基本原理 150

二、反转录PCR的基本步骤 150

三、反转录PCR的影响因素 151

第六节 PCR技术的应用 151

一、PCR技术在分子生物学领域的应用 151

二、PCR技术在临床医学领域的应用 153

思考题 154

参考文献 154

第11章 蛋白质结构与功能研究的手段 155

第一节 蛋白质结构分析 155

一、蛋白质一级结构——氨基酸组成与序列测定 156

二、蛋白质的高级结构分析 159

第二节 蛋白质功能研究 160

一、蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法 161

二、蛋白质—DNA相互作用的研究方法 164

第三节 蛋白质功能研究的其他策略 165

一、蛋白质芯片技术 165

二、质谱在大规模蛋白质相互作用分析中的应用 165

三、串联亲和纯化 166

四、纳米技术 167

五、RNA干扰 167

六、miRNA 169

思考题 170

参考文献 170

第12章 生物信息学分析的基本方法 171

第一节 核酸和蛋白质数据库 171

一、核酸序列数据库 171

二、蛋白质序列数据库 174

第二节 综合信息检索系统 174

第三节 序列比对分析 176

第四节 生物信息学数据库的数据挖掘 178

思考题 179

参考文献 179

实验第一部分 生物化学实验 180

实验一 蛋白质的变性、凝固及沉淀反应 180

一、蛋白质的加热变性凝固 180

二、蛋白质沉淀反应 180

实验二 血清白蛋白、γ-球蛋白的分离纯化及鉴定 183

一、分离纯化 183

二、醋酸纤维素薄膜电泳 187

实验三 蛋白质的定量实验 190

一、紫外吸收法 190

二、劳里法（Lowry法） 191

三、染料法 192

实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量 193

实验五 蛋白质印迹分析 198

实验六 碱性磷酸酶的分离纯化及比活性的测定 200

实验七 酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响 204

一、酶的特异性 204

二、温度对酶活性的影响 205

三、pH对酶活性的影响 205

实验八 碱性磷酸酶的Km值测定及磷酸盐对碱性磷酸酶的抑制作用 207

一、碱性磷酸酶的Km值测定 207

二、磷酸盐对碱性磷酸酶的抑制作用 208

实验九 脲酶Km值简易测定 210

实验十 乳酸脱氢酶同工酶分析 212

实验十一 乳酸脱氢酶及辅酶的作用 214

实验十二 激素对血糖的调节 216

激素对血糖浓度的影响（葡萄糖氧化酶法） 216

实验十三 血清转氨酶活性的测定 217

实验十四 血清总胆固醇测定（硫磷铁法） 220

实验十五 尿素氮测定及回收率 221

实验第二部分 分子生物学实验 224

实验十六 载体的选择和制备 224

质粒DNA的制备与纯化 224

实验十七DNA的纯度、浓度和构象分析 226

实验十八 目的基因的获取 229

一、DNA为模板的PCR扩增实验 229

二、RT-PCR——mRNA反转录生成cDNA 231

实验十九 DNA的限制性内切酶消化 233

实验二十 DNA片段回收 235

实验二十一 DNA片段的连接反应 237

实验二十二 用重组质粒DNA转化大肠杆菌 238

实验二十三 含重组质粒的细菌菌落的鉴定 240

实验二十四 地高辛精标记核酸探针的斑点杂交及免疫检测 242

实验二十五 生物信息学分析基本方法实验 244

附录一 实验须知 245

一、实验室规则 245

二、实验室常识 245

三、实验室安全 246

四、实验室急救 246

五、移液器的使用及注意事项 247

六、玻璃仪器的清洗及各种洗涤液的配制 248

附录二 生物化学常用试剂的配制及参数 250

一、常用缓冲溶液的配制 250

二、百分浓度酸、碱溶液的配制 253

三、易变质及需要特殊方法保存的试剂 253

四、常用酸碱相对密度和浓度的关系 254

五、冷却剂和干燥剂 254

六、色谱法常用资料 256

七、常用放射性核素及测量单位 259

八、离心机转数 260

九、基本单位的词头 260

十、常用药品中英文对照及其分子式和相对分子质量 261

附录三 分子生物学实验中常用的数据资料 267

一、常用的数据资料 267

二、常用贮存液的配制 270