现代分子生物学实验手册 第2版PDF电子书下载

第一章　基础篇 1

第一节 分子生物学实验室常用基本器具 1

一、常用基本器具 1

二、常用器具的材料 5

第二节　通用实验设备及其使用方法 8

一、天平 8

二、pH计 10

三、分光光度计 10

四、微量移液器 11

五、离心机 13

六、恒温箱 15

七、振摇器 16

八、超净工作台 18

第三节　实验室基础准备工作 18

一、实验用水的制备 18

二、消毒灭菌 20

三、液氮的使用 23

四、实验器具的硅化 24

五、实验用醇及酚类的准备 25

第四节　实验用试剂 27

一、分子生物学实验室常用试剂浓度表示法 27

二、试剂的保存 28

三、实验室中试剂的管理 28

第五节　安全防护 28

一、放射性核素的防护 28

二、危险化学试剂及防护 29

三、生物安全防护 30

第二章　核酸的基础理论 31

第一节　核酸 31

一、核酸的组成与结构 31

二、核酸的理化特性 36

三、核酸的光谱学 38

四、核酸的降解与合成 39

第二节　基因与染色体 41

一、基因 41

二、染色体 46

第三节　细胞分裂周期 51

一、有丝分裂 51

二、减数分裂 53

第四节　遗传信息的传递 57

一、复制 57

二、转录 60

三、翻译 66

第三章　核酸的制备 70

第一节　真核细胞DNA的制备 70

一、概论 70

二、从培养的动物细胞或组织中提取高分子质量DNA 73

三、血液样品中DNA的制备 76

四、残存蛋白质和RNA的检测 77

五、真核细胞基因组DNA制备中的注意事项 78

第二节 细菌细胞DNA的提取 78

一、试剂 78

二、实验流程 79

三、制备大分子质量细菌DNA的几个关键步骤 79

第三节　质粒DNA的分离纯化 80

一、概论 80

二、氯化铯密度梯度离心法 82

三、碱裂解法 83

四、煮沸法 85

五、试剂盒提取及纯化质粒 85

第四节　RNA的制备 86

一、RNA的结构和分布 86

二、RNA制备中的关键因素 89

三、组织细胞总RNA分离制备 91

第四章　电泳技术 94

第一节 电泳技术的基本原理 94

第二节　影响泳动率的因素 95

一、样品 95

二、支持介质 95

三、电场强度 96

四、缓冲液的离子强度 97

第三节 凝胶电泳的基本技术和条件 97

一、核酸凝胶电泳的分类 97

二、缓冲液系统 98

三、样品的配制 99

四、电泳条件的考虑 100

五、染色 100

六、电泳结果的记录 101

第四节　琼脂糖凝胶电泳 102

一、仪器设备及材料 103

二、电泳操作步骤 104

第五节　碱性琼脂糖凝胶电泳 106

第六节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 107

一、仪器设备及试剂 108

二、制胶准备 109

三、制胶 110

四、电泳 111

五、染色及结果观察 111

第七节 双向电泳 111

一、等电聚焦电泳 113

二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 122

三、双向电泳结果的分析鉴定 127

第八节 凝胶扫描、成像系统 131

第五章　工具酶 133

第一节　限制性内切酶 133

一、概述 133

二、常用的三种内切酶 135

三、其他类型内切酶 138

四、甲基化酶 139

五、与内切酶相关的几个概念 140

六、限制性内切酶酶切反应 142

七、DNA分子的限制性内切酶酶谱 143

第二节　DNA重组常用的其他酶类 145

一、DNA聚合酶 145

二、RNA聚合酶 147

三、DNA连接酶 147

四、反转录酶 148

五、核糖核酸酶A 148

六、核糖核酸酶T1 148

七、核糖核酸酶H 149

八、核糖核酸酶U2、核糖核酸酶CL3 149

九、脱氧核糖核酸酶Ⅰ 149

十、核酸酶S1 149

十一、核酸酶Ba131 149

十二、核酸外切酶 149

十三、末端转移酶 150

十四、多核苷酸激酶 150

十五、碱性磷酸酯酶 150

第六章　基因克隆技术 151

第一节 目的基因DNA的制备 151

一、从染色体中获得 151

二、人工合成 153

三、聚合酶链式反应扩增特定的基因片段 153

第二节　基因克隆载体 153

一、质粒 154

二、噬菌体 162

三、真核细胞为宿主的克隆载体 171

四、反转录病毒载体 178

第三节 DNA分子的体外重组 179

一、DNA连接酶 179

二、外源性基因DNA片段与载体DNA的连接 182

三、影响DNA连接的因素 187

四、DNA在凝胶内的连接 187

第四节　重组DNA导入宿主细胞 188

一、转化的方法 189

二、氯化钙法转化大肠杆菌（全部过程需无菌操作） 190

三、重组DNA克隆的筛选与鉴定 191

第五节　基因组文库的构建 195

一、构建基因文库的准备条件 196

二、基因文库的构建 199

第六节　cDNA文库的构建 207

一、总RNA的提取及mRNA的制备 207

二、cDNA文库的构建 209

第七章　聚合酶链式反应 215

第一节　PCR基本原理 215

一、基本原理 215

二、“长产物片段”与“短产物片段” 217

三、平台效应 217

第二节　PCR反应条件的优化 219

一、标准PCR反应流程 219

二、PCR反应条件的优化 220

第三节　引物的设计 224

一、设计原则 224

二、引物长度 224

三、引物的5端修饰法 225

四、简并引物 226

五、嵌套引物 228

第四节 PCR反应模板的制备 228

第五节　耐热DNA聚合酶 229

一、Taq DNA聚合酶 229

二、其他耐热DNA聚合酶 232

第六节　热启动PCR 233

一、热启动PCR的原理 233

二、热启动PCR的几种技术 233

第七节　降落PCR 235

第八节 PCR相关技术的发展 236

一、不对称PCR 237

二、多重PCR 238

三、着色互补PCR 239

四、巢式PCR 239

五、锚定PCR 240

六、反向PCR 240

七、锅柄PCR 242

八、增敏PCR 242

九、重组PCR 242

十、表达PCR 244

十一、原位PCR 244

十二、RNA的聚合酶链反应 245

十三、cDNA末端快速扩增 246

十四、差异显示PCR 251

十五、定量PCR 251

第九节　PCR产物的检测 260

一、琼脂糖凝胶电泳 260

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 260

三、层析技术 261

四、分子杂交 261

五、微孔板夹心杂交法 261

六、限制性内切酶酶切分析 261

七、酶免疫法检测PCR 262

八、PCR扩增产物的直接测序 262

第十节　PCR的污染及对策 263

一、PCR污染 263

二、污染的预防 263

三、对照实验 263

四、污染源的处理 264

第十一节　PCR技术的应用 265

一、基因分析 265

二、定序克隆 270

三、序列分析 271

第八章　核酸分子探针的标记 273

第一节　概述 273

一、探针的种类及其选择 273

二、各种标记物及其选择 274

三、各种标记方法及其选择 278

第二节 非放射性DIG标记方法 279

一、非放射性DIG标记方法的比较 279

二、PCR标记法 280

三、随机引物标记法 283

四、体外转录标记RNA探针 285

五、三种标记方法重要参数的比较简表 289

第三节 探针标记效率的评估 289

一、直接检测过程 290

二、琼脂糖凝胶电泳分析PCR标记探针 290

第九章　核酸分子杂交 292

第一节　Southern杂交 292

一、琼脂糖凝胶分离DNA样品 292

二、DNA的转膜（Southern印迹、虹吸印迹法） 293

三、预杂交 295

四、DIG标记的DNA探针与靶DNA的杂交 296

第二节 RNA探针的Northern杂交 300

一、琼脂糖凝胶分离RNA样品 300

二、RNA的转膜（Northern印迹，虹吸印迹法） 302

三、预杂交 302

四、DIG标记的RNA探针与RNA的杂交 303

五、做核酸杂交时，如何取得良好结果 304

第三节 非放射性核素探针的检测 305

一、光学检测 305

二、化学发光检测 307

第四节　使用DIG标记的探针进行菌落和噬菌斑的杂交 309

一、菌落／噬菌斑滤膜的准备步骤 309

二、DIG标记的DNA探针与菌落／噬菌斑滤膜的杂交 310

三、化学发光法检测探针-靶基因杂交信号 311

四、显色法检测探针-靶基因杂交信号 311

五、菌落／噬菌斑杂交的影响因素 312

第五节　核酸原位杂交 312

一、核酸原位杂交的基本要点 312

二、结果的评定 315

附：Western印迹检测表达蛋白质 315

一、哺乳细胞的裂解 316

二、蛋白质的电转移 316

三、封闭 317

四、靶蛋白与第一抗体反应 317

五、与第二抗体反应 317

六、显色 318

第十章　测序 319

第一节　概论 319

第二节　Sanger双脱氧法 320

一、基本原理 320

二、经典测序反应——M13单链测序系统 322

三、双链DNA测序反应系统 330

四、循环测序法 333

五、PCR产物直接测序 335

第三节 Maxmam-Gilbert化学法 338

一、化学法基本原理 338

二、化学法测序的一般流程 338

三、化学法的优缺点 341

第四节　杂交测序 342

第五节 自动化测序 345

一、自动化测序仪 345

二、全自动化测序流程 351

第六节 DNA大片段序列测定的战略 356

一、随机测序 356

二、定向测序法 360

三、全基因组测序策略 362

第七节 DNA测序技术新进展 364

第十一章　新技术 368

第一节　mRNA差异显示技术 368

一、概述 368

二、基本原理 371

三、实验设计和优化 372

四、实验操作 378

五、差异显示技术衍生的方法 386

六、差异显示技术的应用 387

七、存在的问题和解决的策略 394

八、展望 395

第二节　生物芯片 396

一、生物芯片技术的基本原理 397

二、生物芯片技术的特点 397

三、生物芯片的应用 398

四、生物芯片技术存在的问题及发展前景 400

第三节 激光捕获纤维切割技术 402

一、LCM技术的主要原理及简单操作 402

二、LCM技术的特点、存在问题及相应对策 403

三、LCM技术在生命科学研究中的应用状况 404

四、LCM技术的发展前景 405

第四节 小干扰RNA 406

一、siRNA的作用机制 406

二、siRNA的特点 406

三、siRNA技术的关键步骤 407

四、siRNA的应用 408

五、不足与展望 410

第十二章 生物信息学及其在分子生物技术中的应用 412

第一节 概述 412

一、生物信息学的概念 412

二、生物信息学的发展 413

三、生物信息学的研究现状 415

第二节 生物信息学的研究方法和内容 417

一、研究方法 417

二、研究内容 431

第三节　生物信息数据库 435

一、生物信息数据库及其分类 435

二、生物信息数据库介绍 436

三、数据库的查询 438

四、全球生物信息数据库 439

第四节　序列比对和数据库搜索 450

一、序列比对 450

二、数据库搜索 451

第五节 生物信息学的应用 454

一、序列分析 454

二、核酸序列装配和拼接 461

三、电子基因定位 462

四、基因表达的电子组织分布 464

五、功能预测 464

六、蛋白质结构预测 467

七、向数据库提交序列 468

八、SNP分析 469

九、蛋白质组数据分析 469

第六节　研究实例 472

一、实例一 472

二、实例二 476

三、实例三 477

四、其他研究路线 478

第十三章　蛋白质组学相关技术 481

第一节　概述 481

一、蛋白质组学产生的背景及概念 481

二、蛋白质组学的主要研究内容 482

三、蛋白质组学的研究方法 482

四、蛋白质组学的发展趋势 484

第二节 蛋白质提取与样品制备 484

一、离液剂、表面活性剂及还原剂的选择 484

二、细胞蛋白质样品的制备 485

三、体液蛋白质样品的制备 485

四、组织细胞蛋白质样品的制备 486

第三节　蛋白质组分离技术 488

一、双向电泳及荧光差异双向电泳 488

二、高效液相色谱 490

三、毛细管电泳及毛细管电色谱 491

第四节　质谱技术 491

一、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱 491

二、电喷雾电离质谱 492

第五节 蛋白质芯片技术 493

一、表面增强激光解吸／离子化蛋白质芯片技术 493

二、液体芯片-飞行时间质谱技术——CLINPROT系统 494

三、抗体芯片 494

第十四章　细胞培养技术 496

第一节 细胞培养室和基本设备准备 496

一、细胞培养的设备和器具 496

二、实验器材的处理及消毒 497

第二节　培养用液 498

一、水与平衡盐溶液 498

二、培养液 499

三、体外培养的其他常用液 500

第三节 原代培养和传代培养 501

一、原代培养的过程 501

二、传代培养的过程 503

第四节 培养物的冻存与复苏 503

一、冷冻保存方法 503

二、冻存细胞的复苏 504

第五节　正常细胞培养 504

一、鼠成纤维细胞的分离与培养 504

二、上皮细胞的培养 505

三、成骨细胞的培养 506

四、胎鼠大脑皮质神经元的培养 507

第六节　肿瘤细胞的培养 508

一、肿瘤组织细胞的原代培养 508

二、肿瘤细胞的传代 511

三、肿瘤细胞的克隆培养法 511

四、肿瘤细胞系 513

第七节　干细胞培养 513

一、人骨髓间充质干细胞的分离培养 513

二、小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）的体外培养及分化 514

三、大鼠胚胎大脑海马神经干／祖细胞培养 516

四、人脑肿瘤干细胞（brain tumor stem eells,BTSC）分离和培养 517

附录 521

一、遗传密码子表 521

二、常用的缓冲液和试剂 521

三、铬酸洗液及配制方法 528

四、放射性核素资料 529

五、核酸及蛋白质数据 530

六、常用分子质量标准参照物 531

七、细胞培养中出现的常见问题、原因及解决方法 533

八、分子生物学研究中的网上资源 534

缩略语 535

索引 540