分子克隆实验指南 精编版PDF电子书下载

第1章　分子克隆中使用的质粒载体的制备方案1.1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备 1

方案1.2　SDS碱裂解法制备质粒DNA：中量制备 3

方案1.3　SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 5

方案1.4　煮沸法小量制备质粒DNA 7

方案1.5　煮沸法大量制备质粒DNA 9

方案1.6　用牙签挑取菌落小量制备质粒DNA 11

方案1.7　SDS裂解法制备质粒DNA 13

方案1.8　聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA 15

方案1.9　层析法纯化质粒DNA 17

方案1.10　氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA：连续梯度法 18

方案1.11 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA：不连续梯度法 20

方案1.12　有机溶剂萃取法从DNA中去除溴化乙锭 22

方案1.13　离子交换层析法从DNA中去除溴化乙锭 24

方案1.14 NaCl离心法去除质粒DNA样品中的小片段核酸 25

方案1.15　Sephacryl S-1000层析法去除质粒DNA样品中的小片段核酸 26

方案1.16 氯化锂沉淀法去除质粒DNA样品中的小片段核酸 28

方案1.17　在质粒载体中进行定向克隆 29

方案1.18　在黏性末端上连接接头 31

方案1.19　在质粒载体中进行平末端克隆 33

方案1.20　质粒DNA的去磷酸化 36

方案1.21　平末端DNA连接合成的接头 38

方案1.22　在低熔点琼脂糖中连接质粒和目的DNA 40

方案1.23 制备和转化大肠杆菌感受态的Hanahan方法：高效的转化方法 42

方案1.24　制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：超级感受态细胞 45

方案1.25　氯化钙制备大肠杆菌感受态 48

方案1.26　大肠杆菌的电转化 50

方案1.27　用X-gal和IPTG筛选细菌克隆：α互补 52

方案1.28　小量细菌克隆的杂交筛选 53

方案1.29 中量细菌克隆的杂交筛选 54

方案1.30　大量菌落的杂交筛选 56

方案1.31 菌落的裂解和DNA与滤膜的结合 58

方案1.32　在滤膜上进行细菌DNA的杂交 59

第2章　λ噬菌体及其载体 63

方案2.1　λ噬菌体的平板培养 63

方案2.2　λ噬菌体噬菌斑的挑取 65

方案2.3　通过平板裂解和洗脱制备λ噬菌体原种 66

方案2.4　用小量液体培养制备λ噬菌体原种 68

方案2.5　λ噬菌体的大规模培养：低倍数感染 69

方案2.6　从大规模裂解物中沉淀λ噬菌体颗粒 70

方案2.7　通过凝胶电泳测定λ噬菌体原种和裂解物中DNA的含量 72

方案2.8　通过CsCl等密度梯度离心纯化λ噬菌体颗粒 73

方案2.9　通过甘油分级梯度离心纯化λ噬菌体颗粒 76

方案2.10　通过沉淀／离心纯化λ噬菌体颗粒 77

方案2.11 用蛋白酶K和SDS从大规模培养物中提取λ噬菌体DNA 78

方案2.12　用甲酰胺从大规模培养物中提取λ噬菌体DNA 79

方案2.13　用作克隆载体的经单一限制性酶切割的λ噬菌体DNA的制备 81

方案2.14　用作克隆载体的双限制性酶切割的λ噬菌体DNA的制备 83

方案2.15　λ噬菌体载体DNA的碱性磷酸酶处理 85

方案2.16　λ噬菌体臂的纯化：通过蔗糖密度梯度离心 88

方案2.17　用于基因组文库中的真核DNA的部分酶切：预反应 91

方案2.18　用于基因组文库的真核DNA的部分酶切：制备反应 92

方案2.19 λ噬菌体臂与外源DNA片段的连接 94

方案2.20　基因组文库的扩增 96

方案2.21 噬菌体DNA从噬菌斑转移到滤膜 98

方案2.22　噬菌体DNA在滤膜上的杂交 101

方案2.23　λ噬菌体快速分析：从平板裂解物中纯化λDNA 103

方案2.24　λ噬菌体分离物的快速分析：从液体培养物中纯化λDNA 106

第3章　M13噬菌体载体 109

方案3.1　M13噬菌体铺平板 109

方案3.2　M13噬菌体液体培养 111

方案3.3　M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备 112

方案3.4　M13噬菌体单链DNA的制备 14

方案3.5　单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备 116

方案3.6　M13噬菌体作为克隆载体 118

方案3.7　重组M13噬菌体克隆的分析 121

方案3.8　用噬菌粒载体制备单链DNA 122

第4章　高容量载体的应用 126

方案4.1　用黏粒载体构建基因组DNA文库 126

方案4.2　通过杂交方法筛选未经扩增的黏粒文库：在杂交膜上涂铺文库 130

方案4.3　黏粒文库的扩增和保存：在液体培养基中扩增 132

方案4.4　黏粒文库的扩增和保存：在膜上扩增 133

方案4.5　噬菌体P1及其克隆系统的应用 135

方案4.6　在E.coli宿主间转移P1克隆 138

方案4.7　细菌人工染色体基本操作 139

方案4.8　从小规模培养物中分离BAC DNA 141

方案4.9　从大规模培养物中分离BAC DNA 142

方案4.10　酵母人工染色体的应用 145

方案4.11　酿酒酵母的培养和DNA制备 146

方案4.12　酵母DNA的小规模制备 148

方案4.13　用PCR方法鉴定酵母克隆 150

方案4.14　克隆在高容量载体上的基因组DNA片段末端的分离：小载体PCR 152

第5章　DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳方案5.1　琼脂糖凝胶电泳 155

方案5.2　琼脂糖凝胶中DNA的检测 158

方案5.3　 琼脂糖凝胶中DNA的回收：DEAE-纤维素膜电泳 159

方案5.4　琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收：电洗脱至透析袋 162

方案5.5 阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA 164

方案5.6　低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提 166

方案5.7　低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：用琼脂糖酶消化 167

方案5.8　碱性琼脂糖凝胶电泳 169

方案5.9 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 171

方案5.10　聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测 174

方案5.11 聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测 175

方案5.12　聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法 177

方案5.13 脉冲场凝胶电泳的DNA制备：哺乳动物细胞和组织DNA的分离 179

方案5.14 脉冲场凝胶电泳的DNA制备：酵母DNA的分离 181

方案5.15 限制性内切酶消化琼脂糖凝胶栓中的DNA 183

方案5.16　脉冲场凝胶电泳的分子量标准 185

方案5.17　横向交变脉冲场凝胶电泳（TAFE） 186

方案5.18　箝位匀强脉冲场凝胶电泳 189

方案5.19　脉冲场凝胶中DNA片段的直接回收 191

方案5.20 回收脉冲场凝胶中的DNA片段并浓缩 193

第6章　真核基因组DNA的制备和分析 196

方案6.1　用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA 196

方案6.2　用甲酰胺从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA 201

方案6.3　用缠绕法从哺乳动物细胞中分离DNA 203

方案6.4　从96孔微量滴定板上生长的哺乳动物细胞中分离DNA 205

方案6.5　从鼠尾或其它小样本中制备基因组DNA 207

方案6.6 哺乳动物DNA的快速分离 209

方案6.7　酵母DNA的快速分离 211

方案6.8　Southern印迹：用毛细管转移DNA到膜上 212

方案6.9　Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶同时向两张膜转移 217

方案6.10　放射性标记的探针与固定在膜上的核酸的Southern杂交 219

第7章　真核细胞mRNA的提取、纯化和分析方案7.1 用酸性苯酚-硫氰酸胍-氯仿从细胞和组织中抽提纯化RNA 224

方案7.2 一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质 226

方案7.3 oligo（dT）-纤维素层析法分离poly(A)+RNA 229

方案7.4　批量层析法分离poly(A)+RNA 231

方案7.5 根据大小分离RNA：琼脂糖凝胶电泳分离乙醛酸化的RNA 233

方案7.6 按大小分离RNA：含甲醛的琼脂糖凝胶电泳分离RNA 235

方案7.7　变性的RNA转移、固定至膜 237

方案7.8　Northern杂交 241

方案7.9　纯化的RNA的斑点杂交和狭缝杂交 243

方案7.10　用核酸酶S1对RNA作图 245

方案7.11 核糖核酸酶保护：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图 251

方案7.12 引物延伸法分析RNA 255

第8章　聚合酶链反应体外扩增DNA 260

方案8.1　聚合酶链反应 260

方案8.2 制备克隆用PCR产物的纯化 262

方案8.3　通过超滤去除DNA扩增产物中的寡核苷酸及过剩dNTP 264

方案8.4　PCR产物的平末端克隆 265

方案8.5 克隆PCR产物至T载体 267

方案8.6　通过PCR在扩增的DNA产物末端引入限制性内切酶位点 269

方案8.7　应用PCR的遗传工程 271

方案8.8 应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR） 274

方案8.9 cDNA 5′末端的快速扩增（5′-RACE） 277

方案8.10 cDNA 3′末端的快速扩增（3′-RACE） 281

方案8.11 应用混合寡核苷酸引物引导的cDNA扩增（MOPAC） 284

方案8.12　原核载体中DNA克隆片段的快速鉴定 287

方案8.13 长距离PCR 289

方案8.14　反向PCR 291

方案8.15 定量PCR 294

方案8.16 差异显示PCR 297

第9章　放射性标记DNA探针与RNA探针的制备方案9.1 随机引物法：利用随机寡核苷酸延伸法对纯化DNA片段进行放射性标记 303

方案9.2 随机引物法：在熔化琼脂糖存在下利用随机寡核苷酸延伸法进行DNA的放射性标记 305

方案9.3　利用聚合酶链反应制备放射性标记DNA探针 307

方案9.4　从M13噬菌体模板合成固定长度的单链DNA探针 309

方案9.5　从M13噬菌体模板合成非固定长度的单链DNA探针 312

方案9.6　体外转录合成单链RNA探针 315

方案9.7 用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针 318

方案9.8　用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针 320

方案9.9　用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记 324

方案9.10 利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3′端 327

方案9.11 利用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3′端 329

方案9.12 用［α-32P］3′-脱氧腺苷5′-三磷酸或［α-32P］双脱氧ATP进行双链DNA 3′突出端的末端标记 331

方案9.13　用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化 332

方案9.14　含5′突出羟基端的DNA分子的磷酸化 334

方案9.15　去磷酸化的5′平端或5′凹端DNA分子的磷酸化 336

方案9.16　通过交换反应进行5′突出端DNA分子的磷酸化 338

第10章　人工合成的寡核苷酸探针 341

方案10.1　用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化合成的寡核苷酸 341

方案10.2　寡核苷酸5′末端磷酸化 345

方案10.3 乙醇沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸 347

方案10.4　CPB沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸 348

方案10.5　大小排阻层析法纯化放射性标记的寡核苷酸 349

方案10.6　用Sep-Pak C18柱层析法纯化放射性标记的寡核苷酸 351

方案10.7　用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段标记合成的寡核苷酸 352

方案10.8　寡核苷酸探针液相杂交：用含季铵盐缓冲液洗涤 355

方案10.9　解链温度的实验测定 357

第11章　cDNA文库制备及基因鉴定 361

方案11.1 cDNA文库的构建 361

阶段1　反转录酶催化合成cDNA第一链 361

阶段2　cDNA第二链的合成 363

阶段3 cDNA的甲基化 366

阶段4　与接头或衔接子的连接 368

阶段5 Sepharose CL-4B凝胶过滤分离cDNA 371

阶段6　cDNA与λ噬菌体臂的连接 373

方案11.2　真核表达文库的构建与筛选 374

阶段1　在真核表达载体上构建和筛选cDNA文库 374

阶段2　在真核表达载体上构建的cDNA文库的筛选 376

方案11.3　外显子捕获与扩增 379

阶段1　文库的构建 379

阶段2 电穿孔法将文库DNA转染COS-7细胞 382

阶段3　mRNA的提取 383

阶段4　反转录PCR 385

阶段5　克隆分析 389

方案11.4 用大片段基因组DNA克隆直接筛选cDNA 391

第12章　DNA测序 397

方案12.1　建立随机重叠DNA插入文库 397

方案12.2　用于双脱氧链终止法测序的变性双链DNA模板制备 402

方案12.3　用T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）进行双脱氧测序反应 404

方案12.4 用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段及单链DNA模板进行双脱氧测序反应 408

方案12.5　用Taq DNA聚合酶进行双脱氧测序反应 411

方案12.6　循环测序：用PCR和末端标记的引物进行双脱氧测序反应 414

方案12.7　化学测序法 417

方案12.8　变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 420

方案12.9　含甲酰胺的变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 423

方案12.10　配制电解质梯度凝胶 424

方案12.11 DNA测序凝胶的加样和电泳 425

方案12.12　放射自显影与测序凝胶的解析 428

第13章　诱变 431

方案13.1 含尿嘧啶的单链噬菌体M13 DNA制备 431

方案13.2　寡核苷酸指导的单链DNA诱变 434

方案13.3 以双链DNA为模板的体外诱变：用DpnⅠ选择突变体 437

方案13.4 通过单一限制位点消除进行寡核苷酸指导的诱变（USE诱变） 440

方案13.5　利用大引物PCR在同一试管中进行高效快速定点诱变 444

方案13.6　重叠延伸法产生特专一位点诱变 446

方案13.7　用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆 449

方案13.8　利用单链构象多态性分析方法检测突变 454

方案13.9　利用外切核酸酶Ⅲ消化产生多组嵌套缺失突变体 458

方案13.10　利用BAL31核酸酶消化法产生套缺失突变体 460

第14章　表达文库的筛选 465

方案14.1　筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库 465

方案14.2　筛选构建于质粒载体的表达文库 470

方案14.3　抗血清中交叉反应抗体的去除：假筛选 476

方案14.4　抗血清中交叉反应抗体的去除：与E.coli裂解液孵育 477

方案14.5　抗血清中交叉反应抗体的去除：亲和层析 479

方案14.6　λ噬菌体表达文库中DNA结合蛋白的鉴定 480

方案14.7　λ溶原噬菌体编码的融合蛋白裂解液的制备：细菌菌落的裂解 484

方案14.8　λ溶原噬菌体编码的融合蛋白裂解液的制备：琼脂平板的裂解性感染 487

方案14.9　λ溶原噬菌体编码的融合蛋白裂解液的制备：液体培养基中的裂解性感染 489

第15章　克隆基因在大肠杆菌中的表达方案15.1 利用IPTG可诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆基因 491

方案15.2　利用T7噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因 493

方案15.3　利用噬菌体λpL启动子在大肠杆菌中表达克隆基因 496

方案15.4 利用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号肽序列分泌表达外源蛋白 499

方案15.5　利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白 502

方案15.6　利用直链淀粉树脂亲和层析纯化麦芽糖结合蛋白融合蛋白 504

方案15.7　利用固化Ni2＋吸收色谱纯化带His标签的蛋白 507

方案15.8　从包含体中纯化表达蛋白 509

第16章　克隆基因转入培养的哺乳动物细胞方案16.1　脂质体介导的DNA转染 514

方案16.2　磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 517

方案16.3　磷酸钙介导的高分子量基因组DNA转染真核细胞 520

方案16.4　DEAE-葡聚糖介导的高效转染 522

方案16.5　利用电穿孔技术介导DNA转染细胞 524

方案16.6　利用基因枪技术介导DNA转染细胞 527

方案16.7　利用Polybrene介导DNA转染细胞 529

第17章　哺乳动物细胞基因表达分析 532

方案17.1 DNA酶Ⅰ足迹法确定蛋白质在DNA序列上的结合位点 532

方案17.2　凝胶阻滞实验确定DNA结合蛋白 537

方案17.3　DNA酶Ⅰ超敏感位点作图 539

方案17.4　行进间转录分析 541

方案17.5 哺乳动物细胞抽提物中氯霉素乙酰转移酶的活性分析 547

方案17.6　哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的活性分析 549

方案17.7　哺乳动物细胞抽提物中β-半乳糖苷酶的活性分析 551

方案17.8 四环素作为调节物诱导目的基因在哺乳动物细胞中的表达 553

阶段1　pTet-tTAk稳定转染成纤维细胞 553

阶段2 四环素调控的目的基因转染可诱导表达tTA基因的NIH-3T3细胞 556

阶段3　分析转染细胞中表达的蛋白质 559

方案17.9　蜕皮激素作为调节物诱导目的基因在哺乳动物细胞中的表达 561

第18章　蛋白质相互作用研究技术 563

方案18.1　双杂交和其它双成分系统 563

阶段1　诱饵-LexA融合蛋白的鉴定 563

阶段2　筛选一个相互作用子 567

阶段3 阳性相互作用的再次确定 571

方案18.2　用GST融合蛋白进行Far Western印迹来检测蛋白-蛋白相互作用 576

方案18.3　用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白-蛋白相互作用 579

方案18.4　通过免疫共沉淀鉴定结合蛋白 581

方案18.5　采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用 584

阶段1　用荧光染料标记蛋白质 584

阶段2　进行FLIM-FRET分析前的准备 587

阶段3 FLIM-FRET测量 589

方案18.6 利用BIAcore通过表面等离子共振光谱学技术分析蛋白质的相互作用 591

阶段1　捕获表面的制备和结合活性测试 591

阶段2　抗原-抗体相互作用的动力学分析 594

附录 597

附录1　分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制 597

1.1　缓冲液 598

1.2　酸和碱 601

1.3　分子生物学中使用的缓冲液和贮存液的配制 601

1.4　有机试剂的配制 616

1.5　化学贮存液 617

1.6　元素周期表 620

1.7　试剂和缓冲液索引 621

附录2　培养基 623

2.1　用于大肠杆菌的液体培养基 624

2.2　含有琼脂或琼脂糖的培养基 626

2.3　贮存培养基 626

2.4　抗生素 627

2.5　用于λ噬菌体操作的溶液 628

2.6　用于酵母繁殖和筛选的培养基 628

2.7　培养基索引 632

附录3　分子克隆中的常用技术 634

3.1　玻璃制品和塑料制品的处理 636

3.2　透析管的处理 636

3.3　细菌培养物的保存 637

3.4　细胞数目的估算 637

3.5　核酸的纯化 639

3.6　核酸的浓缩 640

3.7　核酸的定量 645

3.8　核酸中放射性的测定 650

3.9　污染有溴化乙锭溶液的处理 652

3.10　凝胶过滤层析 653

3.11　通过羟基磷灰石层析分离单链DNA和双链DNA 655

3.12　DNA的片段化 657

3.13　离心 659

3.14　蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 660

3.15　SDS-聚丙烯酰胺凝胶的染色 666

3.16　SDS-聚丙烯酰胺凝胶的干燥 668

3.17　免疫印迹 669

3.18　技术索引 672

附录4　告诫 673

索引 687