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第一章 免疫应答导论 1

单元1.1 酶联免疫吸附试验 1

基本方案间接ELISA法检测特异性抗体 2

备选方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原 4

备选方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原 5

备选方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体 7

备选方案4夹心ELISA法检测同种型 9

备选方案5直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原 9

备选方案6间接细胞ELISA法检测抗细胞表面抗原的特异性抗体 11

辅助方案 十字交叉连续稀释分析法（criss-cross serial-dilution analysis）测定试剂最适浓度 12

单元1.2 多克隆抗血清的制备 14

基本方案使用弗氏佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法 15

备选方案使用其他佐剂制备多克隆抗体的免疫接种法 16

辅助方案从血液中制备血清 17

单元1.3 单克隆抗体的制备 18

基本方案1单克隆抗体制备中的免疫接种 19

基本方案2细胞融合与杂交瘤分选 20

辅助方案1杂交瘤培养上清的筛选分析 23

辅助方案2杂交瘤的建系 23

辅助方案3有限稀释克隆法 24

辅助方案4克隆和扩增用培养基的制备 25

单元1.4 单克隆抗体培养上清与腹水的制备 26

基本方案1单克隆细胞培养上清的制备 26

备选方案1单克隆细胞培养上清的大规模制备 27

备选方案2杂交瘤或细胞系细胞的大规模制备 27

基本方案2含有单克隆抗体的腹水制备 28

单元1.5 免疫球蛋白G（IgG）的纯化 29

基本方案1硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析 29

基本方案2蛋白A交联琼脂糖凝胶亲和层析 31

备选方案1蛋白G交联琼脂糖凝胶亲和层析 32

备选方案2抗大鼠κ链单克隆抗体交联琼脂糖凝胶亲和层析 33

单元1.6 免疫球蛋白G（IgG）片段的水解 34

基本方案1木瓜蛋白酶水解IgG成Fab片段摸索性试验 34

基本方案2木瓜蛋白酶水解IgG获取Fab片段的大量制备 35

基本方案3 胃蛋白酶水解IgG成F（ab′）2片段的摸索性试验 36

基本方案4 胃蛋白酶水解IgG获取F（ab′）2片段的大量制备 37

备选方案 用预先活化的木瓜蛋白酶水解IgG制备F（ab）2 38

单元1.7 免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白D（IgD）的纯化 39

基本方案1用透析和凝胶过滤层析法纯化IgM 39

备选方案1硫酸铵沉淀法纯化IgM 39

备选方案2甘露聚糖结合蛋白亲和纯化IgM 40

备选方案3IgM纯化试剂盒 41

基本方案2凝集素亲和层析法纯化小鼠IgD 41

单元1.8 抗体可变区（V区）的克隆、表达和修饰 42

基本方案1通过使用冗余引物克隆和表达免疫球蛋白可变区 43

辅助方案TA载体的制备 48

基本方案2用ELISA法鉴定转染细胞分泌的抗体分子 49

基本方案3转染细胞分泌抗体分子的鉴定 50

单元1.9 核酸免疫 52

基本方案1小鼠注射接种DNA 53

基本方案2小鼠基因枪接种DNA 55

辅助方案1包裹DNA的金粉颗粒的制备 56

辅助方案2制备包裹有DNA的金粉颗粒的样品管 57

辅助方案3基因枪接种中氦气压力和颗粒大小的最优化 59

第二章 小鼠淋巴细胞功能的体内体外分析 61

单元2.1 小鼠单个核细胞的分离 63

基本方案从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液 63

辅助方案1去除脾脏细胞悬液中的红细胞 63

辅助方案2一步梯度法去除死细胞 64

单元2.2 磁珠法分离T细胞和B细胞 64

基本方案1用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4＋细胞或CD8＋T细胞的自动分离 64

基本方案2使用AUTOMACS系统进行B细胞的自动分选 65

基本方案3使用AUTOMACS系统进行辅助细胞的自动分选 66

备选方案1用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞 66

基本方案4用AUTOMACS系统自动分选CD4＋CD25＋抑制性细胞 67

备选方案2用磁性分选柱手工操作分离CD4＋CD25＋抑制性细胞 68

单元2.3 树突细胞的分离 69

基本方案1塑料黏附和EA玫瑰花结富集DC 70

辅助方案胶原酶消化制备脾脏细胞悬液 72

基本方案2用小鼠骨髓前体细胞培养树突细胞（DC） 73

单元2.4 从小鼠脾脏分离小鼠天然杀伤细胞 75

基本方案 75

单元2.5 B细胞功能的检测 77

基本方案1抗原特异性的抗体产生 77

基本方案2 Jerne-Nordin PFC测定法 81

基本方案3Cunningham-Szenberg PFC测定法 83

备选方案1改良Jerne-Nordin PFC测定法用于型特异性反应 85

备选方案2改良Jerne-Nordin PFC测定法用于测定多克隆抗体反应 85

辅助方案1制备琼脂糖包被的玻片 85

辅助方案2制备Cunningham-Szenberg小室 86

辅助方案3三硝基苯半抗原（TNP）偶联SRBC 86

辅助方案4蛋白质A偶联SRBC 87

辅助方案5制备TNP-卵白蛋白 88

辅助方案6用Percoll梯度离心纯化静息B细胞 88

单元2.6 B淋巴细胞活化的早期事件 90

基本方案1 BCR诱导的B细胞内钙变化 90

基本方案2蛋白质酪氨酸磷酸化的分析 91

基本方案3细胞大小与B细胞活化分子表达的分析 92

单元2.7 B细胞功能的增殖检测方法 93

基本方案抗IgM与LPS刺激的B细胞增殖 93

备选方案1用8-巯基喹啉（8-MG）刺激B细胞多克隆活化 94

备选方案2用蛋白激酶C激活剂及钙离子载体刺激B细胞多克隆活化 95

备选方案3硫酸葡聚糖与poly（I:C）刺激B细胞多克隆活化 95

备选方案4细胞数量增加的定量 95

单元2.8 BrdU检测T细胞和B细胞增殖 96

基本方案 96

单元2.9 采用细胞内荧光染料CFSE检测淋巴细胞的迁移和增殖 97

基本方案淋巴细胞的CFSE标记 97

辅助方案流式细胞仪分析CFSE标记的细胞 99

单元2.10 细胞毒性T淋巴细胞的诱导及检测 101

基本方案1从CTL前体中诱导细胞毒性 101

基本方案2铬释放法分析CTL活性 103

辅助方案1次要组织相容性抗原的小鼠体内应答 105

辅助方案2病毒抗原体内免疫小鼠 105

辅助方案3 TNP修饰靶／刺激细胞 106

辅助方案4病毒感染靶／刺激细胞 106

备选方案1多克隆CTL活性的诱导 106

备选方案2 CTL再定向杀伤活性的检测 107

单元2.11 T淋巴细胞增殖实验 107

基本方案1未致敏T淋巴细胞的活化 107

备选方案1用抗体激活未致敏的T细胞 109

备选方案2 混合淋巴细胞增殖实验 110

辅助方案1从抗原呈递细胞或刺激细胞悬液中剔除T淋巴细胞 110

辅助方案2辅助／刺激细胞的灭活 111

基本方案2致敏T细胞的活化 112

基本方案3 CD4＋CD25＋T细胞的活化和抑制功能的检测 113

备选方案3 CD4＋CD25＋T细胞抑制功能的两步法检测：短期活化和扩增CD4＋CD25＋T细胞并分析其抑制功能 114

单元2.12 T细胞克隆的建立 115

基本方案1产生和维持同种反应性Th和CTL克隆 115

基本方案2用可溶性蛋白抗原诱导Th克隆 116

辅助方案1制备刀豆蛋白A活化的上清（Con A上清） 118

辅助方案2制备混合淋巴细胞培养上清（MLC上清） 118

辅助方案3制备PMA激活的EL-4淋巴瘤细胞上清（EL-4上清） 119

辅助方案4用显微操作的方法克隆 119

单元2.13 制备小鼠T细胞杂交瘤 120

基本方案细胞融合和T细胞杂交瘤的选择 120

辅助方案1筛选表达CD3-TCR原始杂交瘤 123

辅助方案2筛选抗原特异性的杂交瘤 124

单元2.14 检测凋亡和其他形式的细胞死亡 125

基本方案1用活细胞或荧光染料定量细胞活性 125

基本方案2 DNA裂解片段的定量 126

备选方案计数放射性标记的DNA定量细胞中DNA片段 127

辅助方案1用125I UdR和51Cr放射性标记细胞核 127

辅助方案2用3H TdR放射性标记细胞核 128

第三章 细胞活化的生物化学 129

单元3.1 淋巴细胞活化过程中肌醇磷脂周转的分析 130

基本方案1 通过道威克斯（DOWEX）离子交换层析分析［3H］肌醇磷酸 130

备选方案通过HPLC方法分析［3H］肌醇磷酸 131

基本方案2通过薄层层析方法分析肌醇磷脂 132

单元3.2 抗磷酸化酪氨酸的印迹检测 133

基本方案抗磷酸化酪氨酸印迹检测的准备及分析 133

备选方案使用125I标记蛋白A进行检测 135

单元3.3 免疫复合物方法检测酪氨酸蛋白激酶 135

基本方案酪氨酸蛋白激酶的免疫沉淀和自身磷酸化检测 136

备选方案1蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测 138

备选方案2蛋白激酶对外源底物的磷酸化检测 138

单元3.4 识别特异性酪氨酸磷酸化多肽抗体的制备 139

基本方案1 多克隆抗磷酸肽抗体的制备 139

基本方案2制备抗磷酸肽的单克隆抗体 141

辅助方案1肽的合成 144

辅助方案2肽段偶联到Affi-Gel 10亲和性基质 144

辅助方案3磷酸酪氨酸偶联到Affi-Gel 10亲和基质 145

单元3.5 T细胞中丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）活性分析 146

基本方案1免疫复合物蛋白激酶测定 146

基本方案2固相蛋白激酶法检测JNK活性 147

基本方案3 SDS-PAGE后原位检测JNK蛋白激酶活性［“胶内”（IN-GEL）激酶测定］ 149

基本方案4利用磷酸化位点特异性抗体检测MAPK的活化 150

辅助方案制备GST-MAPK底物融合蛋白 151

单元3.6 脂筏的分离和应用 153

基本方案 通过蔗糖梯度浮选法制备去污剂抗性的膜并通过免疫印迹对蛋白质进行分析 153

备选方案用离心法制备去污剂抗性的膜 156

辅助方案1脉冲追踪方法分析去污剂抗性的膜蛋白 157

辅助方案2通过放射性标记检测去污剂抗性的膜蛋白的全部组分 157

辅助方案3 定量高效薄层色谱法（HP-TLC）进行DRM脂质分析 158

辅助方案4DEAE葡聚糖凝胶的制备 161

辅助方案5 C18反相色谱柱的制备 162

辅助方案6用甲基-β-环式糊精去除胆固醇来破坏脂筏 163

辅助方案7 甲基-β-环式糊精（MBCD）处理去除胆固醇的动力学测定 163

辅助方案8使用MBCD-胆固醇复合物进行细胞胆固醇去除 164

第四章 免疫荧光和细胞分离 166

单元4.1 细胞制备和试剂 166

基本方案1单细胞表面抗原的免疫荧光标记 166

基本方案2固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记 167

辅助方案1用异硫氰酸荧光黄（FITC）偶联抗体 169

辅助方案2长臂生物素偶联抗体 170

备选方案1未固定细胞胞内抗原的免疫荧光检测 170

备选方案2用7氨基放线菌素D（7-AAD）标记死细胞 171

单元4.2 流式细胞仪分析技术-BD公司出品的流式细胞仪 172

基本方案FITC偶联抗体的单色分析 173

辅助方案1用校准微球和FACSComp软件进行仪器检测 175

辅助方案2单色分析区分活细胞和死细胞 176

备选方案1 FITC和PE偶联抗体的双色分析 177

辅助方案3双色分析区分活细胞和死细胞 177

备选方案2三色分析 178

备选方案3四色分析 178

第五章 细胞因子及其受体 181

单元5.1 IL-2和IL-4的检测 183

基本方案采用CTLL-2细胞检测小鼠IL-2和IL-4 183

备选方案1采用CTLL-2细胞检测人IL-2 186

备选方案2采用CT.4 S细胞检测小鼠IL-4 186

备选方案3采用CT.h4S细胞检测人IL-4 187

辅助方案1 白细胞介素或T细胞生长因子（TCGF）单位的计算 187

辅助方案2小鼠CTLL-2细胞的维持 188

辅助方案3小鼠CT.4 S细胞的维持 189

辅助方案4小鼠CT.h4S细胞的维持 189

单元5.2 IL-10的检测 190

基本方案 190

单元5.3 IL-12的检测 191

基本方案人和小鼠IL-12 p75异二聚体的ELISA检测方法 192

备选方案人和小鼠IL-12 p40亚基的ELISA检测 193

单元5.4 IL-13的检测 193

基本方案 193

单元5.5 IL-15的检测 194

基本方案 194

单元5.6 IL-18的检测 196

基本方案 196

单元5.7 γ干扰素的检测 197

基本方案 197

单元5.8 流式细胞仪检测细胞内因子 199

基本方案细胞内因子的荧光标记 199

辅助方案1 PMA和ionomycin激活T细胞 200

辅助方案2抗原活化T细胞 201

辅助方案3固定和冻存PBMC 202

辅助方案4 PBMC的细胞表面标记 202

辅助方案5用荧光标记的抗细胞因子抗体标记活化细胞内的细胞因子 203

单元5.9 流式细胞仪检测细胞因子受体 204

基本方案用抗受体单克隆抗体检测人和小鼠的细胞因子受体 204

备选方案1用标记的细胞因子检测细胞因子受体 206

备选方案2多参数分析检测淋巴细胞亚群细胞因子受体的表达 207

辅助方案1单克隆抗体和细胞因子的滴定 208

辅助方案2评价检测试剂 209

单元5.10 用流式细胞仪检测细胞因子的分泌和分离分泌细胞因子的细胞 210

基本方案细胞因子分泌实验 210

备选方案1 PBMC分泌细胞因子的快速检测 212

备选方案2全血细胞分泌细胞因子的快速检测 213

单元5.11 ELISPOT方法检测分泌细胞因子的细胞 214

基本方案 214

单元5.12 α-、β-和γ-干扰素诱导的抗病毒活性的检测 218

基本方案小鼠干扰素诱导的抗病毒活性的检测 218

辅助方案1病毒培养体系的建立 220

辅助方案2抗体中和实验 220

备选方案人干扰素诱导的抗病毒活性的检测 221

单元5.13 趋化因子超家族的生物学反应 221

基本方案1微型趋化实验检测趋化因子对粒细胞的趋化 221

备选方案1微型趋化实验检测趋化因子对单核细胞的趋化 226

备选方案2微型趋化实验检测趋化因子对淋巴细胞的趋化 227

辅助方案细胞外基质蛋白包被聚碳酸酯膜 228

基本方案2趋化因子诱导的淋巴细胞内游离钙离子的检测 228

第六章 天然免疫 231

单元6.1 小鼠巨噬细胞的分离 232

基本方案1小鼠腹腔巨噬细胞的分离 232

基本方案2小鼠骨髓巨噬细胞的分离和培养 233

单元6.2 小鼠巨噬细胞的表型检测 234

基本方案直标法检测小鼠巨噬细胞的表型 235

备选方案间标法检测小鼠巨噬细胞的表型 236

单元6.3 人单核／巨噬细胞的表型检测 237

基本方案 237

单元6.4 小鼠巨噬细胞的活化 239

基本方案小鼠巨噬细胞的活化 239

辅助方案炎性小鼠巨噬细胞的活化 240

单元6.5 巨噬细胞一氧化氮的检测 241

基本方案 241

单元6.6 巨噬细胞吞噬功能和杀伤功能的检测 242

基本方案1巨噬细胞吞噬功能的检测 243

辅助方案 利用FITC区分胞外黏附和胞内吞噬的细菌 244

基本方案2巨噬细胞杀伤功能的检测 244

辅助方案单核细胞增多性利斯特氏菌的制备 245

单元6.7 巨噬细胞抗肿瘤活性的检测 246

基本方案 ［111In］释放法检测巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用 246

辅助方案 ［111In］标记肿瘤靶细胞 249

单元6.8 Fcγ受体介导的黏附作用和吞噬作用的检测 251

基本方案Fcγ受体介导的吞噬作用 251

辅助方案FcγR介导的黏附作用 253

单元6.9 干扰素介导的抗肿瘤作用 254

基本方案 254

单元6.10 人NK T细胞的分离和扩增 255

基本方案1 NK T细胞的鉴定 255

基本方案2免疫磁珠法分离NK T细胞及后续扩增 256

备选方案1 NK T细胞的流式分选及扩增 258

备选方案2 NK T细胞的克隆 258

辅助方案NK T细胞的二次刺激和克隆 259

第七章 抗原加工处理和呈递 261

单元7.1 抗原呈递细胞的选择和制备 261

基本方案通过利斯特氏菌刺激制备腹腔巨噬细胞 262

备选方案1连续注射利斯特氏菌和？蛋白胨后制备腹腔巨噬细胞 263

辅助方案1小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制备 263

备选方案2 Con A刺激的腹腔巨噬细胞的制备 264

备选方案3骨髓来源的巨噬细胞的制备 264

辅助方案2制备L929条件培养基 265

备选方案4制备LPS刺激的B细胞 266

单元7.2 外源性抗原向T细胞的呈递 266

基本方案一种抗原加工处理和呈递的检测体系 267

备选方案1用固定后的贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽 268

备选方案2用固定后的非贴壁型抗原呈递细胞检测加工处理过的抗原肽 269

备选方案3蛋白抗原致敏的细胞固定后检测抗原加工和处理 269

第八章 人类免疫学研究 271

单元8.1 外周血和脐带血中分离单个核细胞 271

基本方案Ficoll-Hypaque梯度离心法分离单个核细胞 272

辅助方案贴壁法去除单个核细胞中的单核细胞和巨噬细胞 272

单元8.2 T细胞亚群的分离纯化 273

基本方案间接淘洗法分离T细胞亚群 273

备选方案抗体依赖补体介导的细胞毒作用分离T细胞亚群 274

辅助方案1 应用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞 275

辅助方案2应用AET处理的绵羊红细胞玫瑰花环形成法分离T细胞 276

单元8.3 免疫磁珠法纯化T细胞 276

基本方案 276

单元8.4 免疫磁珠法分离B细胞亚群 278

基本方案 278

单元8.5 单核细胞／巨噬细胞的分离 280

基本方案1贴壁法分离单核细胞 280

基本方案2根据大小沉降作用分离单核细胞 280

基本方案3对流离心洗淘法分离单核细胞 281

单元8.6 人自然杀伤细胞的分离 283

基本方案从PBMC分离人NK细胞 284

辅助方案阴性选择分离NK细胞的单克隆抗体的滴定 285

单元8.7 流式细胞仪检测全血的人淋巴细胞 286

基本方案 286

单元8.8 淋巴细胞增殖实验 288

基本方案丝裂原诱导的外周血单个核细胞增殖实验 288

备选方案1单向混合淋巴细胞反应 290

备选方案2抗原诱导的T细胞增殖实验 292

辅助方案3H TdR掺入和细胞收集 292

单元8.9 B细胞分泌抗体的检测 293

基本方案 293

单元8.10 ELISA检测抗体的含量 294

基本方案 294

单元8.11 ELISPOT检测抗体的含量 295

基本方案ELISPOT检测分泌抗体的细胞 296

备选方案用ELISPOT检测仪检测分泌抗体的细胞 298

单元8.12 抗体的体内诱导和检测 299

基本方案1蛋白质或多糖抗原体内法诱导抗体的产生 299

基本方案2 ELISA法检测体内抗体的产生 300

辅助方案肺炎球菌多糖与蛋白质的偶联 301

单元8.13 T细胞杀伤功能的检测 302

基本方案1 抗CD3诱导的T细胞杀伤实验 302

基本方案2抗原诱导的特异性T细胞杀伤功能的检测 303

单元8.14 NK/LAK细胞杀伤活性的检测 303

基本方案51Cr释放法检测NK/LAK细胞杀伤活性 304

辅助方案肿瘤靶细胞的制备和标记 306

单元8.15 人T细胞的克隆和扩增 307

基本方案1抗原特异性T细胞的诱导 307

基本方案2 Th1或Th2细胞的诱导 308

辅助方案1 T细胞的克隆 310

辅助方案2克隆后T细胞的扩增 311

辅助方案3 T细胞克隆的冻存 312

单元8.16 制备EBV转化的B细胞 313

基本方案 313

单元8.17 分离人肠黏膜单个核细胞 314

基本方案分离人肠黏膜单个核细胞 314

辅助方案用尼龙毛过滤器去除死细胞 316

单元8.18 人树突细胞分离和培养 317

基本方案1从外周单个核细胞中分离人树突细胞 317

备选方案免疫磁珠法分离树突细胞 319

基本方案2用单核细胞诱导人树突细胞 319

单元8.19 分离和鉴定人自然杀伤细胞亚群 321

基本方案从PBMC中分离人NK细胞 321

辅助方案人NK细胞亚群的表型和功能分析 322

第九章 HIV的检测与分析 326

单元9.1 外周血中HIV的分离和定量检测 327

基本方案1外周血中HIV的培养以及通过TCID定量来测定其滴度 327

基本方案2感染同种异型T淋巴母细胞：原代分离PBMC中的HIV 329

辅助方案评估HIV对CD4＋靶细胞的致细胞病变效应：HIV介导的细胞死亡 329

单元9.2 感染CD4＋原代细胞系及HIV的诱导 330

基本方案1用HIV体外急性感染CD4＋原代细胞及细胞系 330

基本方案2建立HIV慢性感染细胞系 332

基本方案3慢性感染细胞系中HIV的诱导 333

单元9.3 在单核细胞和巨噬细胞中培养HIV 334

基本方案单核细胞来源的巨噬细胞培养和HIV感染 334

备选方案用HIV悬液感染单核细胞来源的巨噬细胞 336

辅助方案1扩增实验室保存的亲巨噬细胞的HIV-1病毒株 336

辅助方案2扩增原代分离的亲巨噬细胞的HIV-1病毒株 337

单元9.4 HIV蛋白的检测 338

基本方案1免疫印迹法检测HIV蛋白 339

基本方案2免疫荧光法检测HIV蛋白 340

备选方案流式细胞仪分析细胞内HIV蛋白 342

基本方案3 HIV反转录酶活性检测 343

单元9.5 用PCR检测HIV的DNA及RNA 345

基本方案1用PCR扩增及检测HIV的DNA 345

基本方案2用RT-PCR检测HIV的RNA 349

单元9.6 体外评价各种制剂的抗HIV活性 352

基本方案1保护靶T细胞免受HIV致细胞病变效应 352

基本方案2表达CD4的HeLa细胞合胞体斑形成抑制试验 353

基本方案3 ELISA检测抗病毒剂对PBMC中HIV p24抗原产生的抑制作用 355

辅助方案50％抑制浓度（IC50）的计算 357

单元9.7 基于痘苗病毒报道基因细胞融合检测法定量功能性测定HIV包膜糖蛋白与受体的相互作用 358

基本方案用质粒表达包膜蛋白及受体进行融合检测 359

备选方案1用重组病毒对各种成分的融合试验 361

备选方案2活化的可溶性CD4融合检测 362

辅助方案1 比色法测定融合-依赖的报道基因活性 362

辅助方案2原位染色测定报道基因活性 363

第十章 自身免疫性及炎症性疾病动物模型 365

单元10.1 小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE） 366

基本方案应用PLP和MBP蛋白或多肽主动诱导EAE 366

备选方案MBP或PLP特异性淋巴细胞被动转移性诱导EAE 369

辅助方案1 PLP蛋白的纯化 369

辅助方案2 MBP蛋白的纯化 370

单元10.2 大鼠佐剂性关节炎 371

基本方案佐剂性关节炎的诱导 371

辅助方案分枝杆菌悬液的制备 373

单元10.3 胶原诱导性关节炎 373

基本方案诱导小鼠胶原性关节炎 374

辅助方案1 Ⅱ型胶原（CII）的纯化 375

辅助方案2胶原（Ⅱ）α1链的纯化 376

辅助方案3胶原（Ⅱ）α1链内溴化氰裂解片段的纯化 377

辅助方案4小鼠关节炎的评定 380

辅助方案5检测CIA小鼠T细胞对CII的增殖应答 381

单元10.4 小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎 382

基本方案1实验性自身免疫性甲状腺炎的诱导和评定 382

辅助方案小鼠甲状腺球蛋白的制备 384

基本方案2诱导EAT耐受 385

单元10.5 小鼠实验性自身免疫性重症肌无力 386

基本方案EAMG的诱导和评定 386

辅助方案1 AChR的抽提与亲和纯化 388

辅助方案2神经毒素3-琼脂糖的制备 390

辅助方案3应用肌电图评定EAMG 391

辅助方案4通过检测抗AChR抗体来评定EAMG 391

辅助方案5小鼠肌肉AChR的制备 393

单元10.6 NOD小鼠：一种胰岛素依赖性糖尿病模型 394

基本方案1无特殊病原菌（SPF）级NOD小鼠的饲养 394

基本方案2胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）的诊断 396

备选方案半定量胰岛炎以作为进展为IDDM的亚临床表现 396

辅助方案胰腺中胰岛细胞的分离 398

单元10.7 通过耗竭调节性T细胞诱导自身免疫性疾病 400

基本方案通过胸腺切除术诱导年轻的成年大鼠糖尿病 400

备选方案应用胸腺切除术诱导3周龄大鼠糖尿病 402

单元10.8 通过耗竭调节性T细胞诱导免疫缺陷小鼠炎症性肠道疾病 402

基本方案转输CD45RBhighCD4＋T细胞诱导SCID小鼠IBD 402

辅助方案监测IBD进展 404

单元10.9 气道高反应性动物模型 406

基本方案应用OVA全身致敏及气道激发诱导气道超敏反应 406

辅助方案1 使用全身体积气压描记器非侵入性检测气道反应性 407

备选方案OVA致敏气道诱导气道超敏反应 408

辅助方案2体外检测气道对电场刺激的反应性 409

辅助方案3 T细胞功能和气道炎症的评定 410

单元10.10 诱导小鼠TNBS结肠炎 411

基本方案小鼠TNBS结肠炎的诱导和评定 411

辅助方案1分离小鼠肠系膜淋巴结细胞 412

辅助方案2分离结肠炎小鼠的黏膜固有层细胞 413

单元10.11 系统性红斑狼疮动物模型 414

基本方案1 ELISA检测小鼠血清中抗染色质抗体 415

基本方案2单链和双链DNA抗体的检测 416

基本方案3 ELISA检测类风湿因子 417

基本方案4 ELISA检测同种异型特异性抗体时标准曲线的制作 417

备选方案ELISPOT检测抗染色质抗体形成细胞 420

辅助方案1低渗裂解鸡红细胞核制备鸡染色质 421

辅助方案2 dsDNA的制备 421

辅助方案3基于PCR技术的faslpr突变体和fasLgld突变体的基因分型 422

第十一章 传染性疾病动物模型 425

单元11.1 利什曼原虫感染的小鼠模型 425

基本方案皮肤利什曼原虫病小鼠模型 425

辅助方案1使用花生凝集素制备后发育期前鞭毛体 427

辅助方案2从足垫组织中纯化无鞭毛体 428

辅助方案3前鞭毛体和无鞭毛体的冷藏和复苏 429

辅助方案4血琼脂培养板的制备 430

单元11.2 弓形虫感染动物模型 430

基本方案1诱导小鼠急性弓形虫T. gondii感染 431

基本方案2小鼠慢性弓形虫脑炎模型 431

基本方案3感染T gondii的重症联合免疫缺陷小鼠 432

基本方案4温度敏感的TS-4 T. gondii菌株的感染模型 432

辅助方案1对T.gondii感染进展和免疫应答的评估 433

辅助方案2 ME49 T.gondii包囊种子库的维持和保存 435

辅助方案3用人类包皮成纤维细胞保存T.gondii速殖子 436

辅助方案4小鼠体内保存T.gondii速殖子 436

辅助方案5 T.gondii裂解物抗原的准备 437

单元11.3 巨细胞病毒感染小鼠模型的建立 438

基本方案巨细胞病毒感染小鼠模型 438

辅助方案1巨细胞病毒的准备 439

辅助方案2唾液腺病毒的制备 440

辅助方案3用空斑形成细胞试验测定巨细胞病毒滴度 441

辅助方案4原代小鼠胚胎成纤维细胞的制备 441

单元11.4 单核细胞增生性利斯特氏菌感染动物模型 442

基本方案用单核细胞增生性利斯特氏菌株感染小鼠 443

辅助方案1小鼠感染利斯特氏菌后的特异性和固有免疫反应评估 444

辅助方案2利斯特氏菌特异性T细胞的制备 445

单元11.5 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染动物模型 447

基本方案1全身性感染LCMV小鼠模型 447

基本方案2 LCMV病毒持续感染小鼠模型 449

基本方案3 T细胞对LCMV免疫反应的测定 450

基本方案4 LCMV疫苗效果的体内检测 451

辅助方案1 LCMV病毒储存液的制备 452

辅助方案2噬菌斑试验测定LCMV病毒滴度 453

辅助方案3 ELISA检测LCMV抗体 454

单元11.6 流感病毒 454

基本方案1流感病毒鼻腔内感染麻醉的小鼠 455

备选方案流感病毒鼻腔内感染未麻醉小鼠 455

辅助方案1流感病毒在鸡胚中扩增 455

辅助方案2鸡胚尿囊液内流感病毒滴度的测定 457

辅助方案3 MDCK细胞的长期培养 458

辅助方案4培养组织流感病毒感染剂量（TCID50）的测定 458

辅助方案5小鼠50％致死剂量（MLD50）和小鼠50％感染剂量（MID50） 459

辅助方案6检测流感病毒滴度的小鼠肺脏制备 461

辅助方案7流感病毒储存液中血凝单位的测定 462

辅助方案8小鼠血清的血凝抑制试验（HAI） 463

辅助方案9 流感病毒储存液（原液）的系列稀释 464

基本方案2从脾脏前体细胞获得流感病毒特异性的细胞毒T淋巴细胞（CTL） 464

基本方案3收集含抗流感病毒CTL的肺脏细胞 465

辅助方案10流感病毒中和试验 466

第十二章 蛋白质分离和分析 468

单元12.1 免疫亲和层析 468

基本方案可溶性或膜结合抗原的分离 468

备选方案1抗原低pH洗脱 471

备选方案2用辛烷基β-D-葡糖苷洗脱抗原 471

单元12.2 免疫沉淀 472

基本方案1用非变性去垢剂裂解细胞制成的悬液进行免疫沉淀 472

备选方案1 用含非变性去垢剂溶液裂解的贴壁细胞进行免疫沉淀 476

备选方案2用含变性去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀 476

备选方案3用无去垢剂裂解液裂解的细胞进行免疫沉淀 476

备选方案4用抗体-Sepharose进行免疫沉淀 477

辅助方案抗体Sepharose的制备 479

备选方案5用与ANTI-Ig结合的放射性标记的抗原进行免疫沉淀 480

基本方案2再次捕获免疫沉淀 480

单元12.3 单向蛋白质凝胶电泳 483

基本方案 483

单元12.4 凝胶蛋白质染色 486

基本方案1考马斯亮蓝染色 486

基本方案2银染 486

基本方案3 SYPRO Orange或SYPRO Red荧光染色 487

基本方案4 SYPRO Ruby荧光染色 488

备选方案1聚丙烯酰胺凝胶上磷蛋白的特异性荧光染色 489

辅助方案磷酸酪氨酸残基的特异性检测 490

备选方案2同一块凝胶上的糖基化蛋白和非糖基化蛋白的差异性荧光染色 491

单元12.5 免疫印迹和免疫检测 492

基本方案1液体容器中的蛋白质印迹 492

备选方案1半干胶系统蛋白质印迹 494

辅助方案1转移蛋白的可逆染色 495

基本方案2采用二抗检测的免疫探针法 495

备选方案2亲和素-生物素化二抗的免疫探针法 496

基本方案3生色底物显色 497

备选方案3生色底物显色 498

辅助方案2膜蛋白解离与再生 499

第十三章 肽 500

单元13.1 合成肽用以制备识别完整蛋白质的抗体 500

基本方案1通过计算机辅助方法选择合适的抗原肽序列 500

备选方案1通过人工筛查挑选合适的肽序列 501

基本方案2设计一条肽链与载体蛋白相偶联 502

备选方案2设计合成一条多价抗原肽 503

基本方案3使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白 504

备选方案3使用双功能团试剂将合成肽偶联至载体蛋白 505

辅助方案计算肽连接到载体蛋白上的摩尔率 505

单元13.2 抗多肽血清的制备 507

基本方案1在兔体内制备抗多肽血清的免疫接种流程 507

基本方案2用间接ELISA法检测抗多肽抗体滴度 507

基本方案3使用酸性、碱性或离液洗脱液的亲和层析柱 508

辅助方案1预先溶胀的NHS或CNBr活化树脂的肽免疫亲和层析柱的制备 509

辅助方案2巯基化树脂填充的肽亲和层析柱的制备 511

单元13.3 采用合成肽组合库鉴定B细胞和T细胞的表位 512

基本方案1采用PS-SCL筛选抗体抑制剂 512

基本方案2筛查PS-SCL鉴定CD4＋或CD8＋T细胞的配体 514

辅助方案优化用于筛查的抗原和抗体浓度 515

第十四章 分子生物学 518

单元14.1 293T细胞包装和扩增反转录病毒 519

基本方案1磷酸钙／DNA沉淀瞬时转染Phoenix反转录包装细胞 519

备选方案1水疱性口炎病毒G蛋白的假型反转录病毒 521

辅助方案1水疱性口炎病毒G蛋白假型反转录病毒的浓缩和低温储存 521

辅助方案2 Phoenix细胞的培养 522

基本方案2感染贴壁细胞 523

备选方案2贴壁细胞快速（spin）感染（见基本方案2） 523

备选方案3悬浮细胞的快速（spin）感染 524

单元14.2 免疫球蛋白融合蛋白的构建 524

基本方案1免疫球蛋白融合蛋白的构建 524

基本方案2免疫球蛋白融合基因分析 526

单元14.3 单链抗体的噬菌体展示技术 529

基本方案1全套单链抗体噬菌体载体的构建 532

基本方案2 scFv展示噬菌体在抗原包被板上的亲和筛选 537

备选方案 链霉亲和素包被的磁珠富集筛选生物素化抗原结合的scFv展示噬菌体 540

基本方案3 ELISA鉴定抗原结合的scFv展示噬菌体 541

辅助方案1辅助噬菌体冻存液的配制 543

辅助方案2指纹图谱和PCR检测克隆的正确性和多样性 544

辅助方案3蛋白质的生物素化（NHS-SS-生物素） 545

辅助方案4利用生物素-蛋白连接酶使蛋白生物素化 545

单元14.4 整体培养中同型转换重排的PCR检测 546

基本方案1通过转换接头的直接PCR 546

辅助方案通过PCR和随机引物标记法制备5′Sμ探针 550

基本方案2消化环化PCR 550

单元14.5 PCR检测细胞因子mRNA的表达 553

基本方案定量IL-2mRNA表达水平 553

单元14.6 PCR检测人T细胞受体基因的表达 556

基本方案PCR检测人T细胞受体基因的表达 556

备选方案PCR定量检测TCR可变序列转录产物 559

辅助方案1重排V-D-J区测序 560

辅助方案2 cDNA合成 562

单元14.7 PCR检测小鼠T细胞受体表达 563

基本方案1 PCR分析小鼠TCR基因表达 563

基本方案2 PCR检测小鼠TCR可变区的频率 567

基本方案3对小鼠可变区转录物进行PCR定量 567

基本方案4序列分析V（D）J区的接头多样性 570

辅助方案cDNA合成用于小鼠TCR基因表达的PCR分析 571

单元14.8 TCR库的抗原谱／免疫扫描技术分析 572

基本方案1人和小鼠TCR受体库多样性的免疫扫描技术分析 574

备选方案利用［32P］dCTP进行免疫扫描分析 580

基本方案2链接区引物进行高特异的分光光度分析 581

基本方案3 TCR基因扩增产物的快速高通量测序 582

单元14.9 多探针核糖核酸酶保护试验同时测定mRNA表达 586

基本方案多探针核糖核酸酶保护试验 586

辅助方案1构建一个核糖探针模板 590

辅助方案2凝胶电泳和结果的可视化 592

单元14.10 端粒长度和端粒酶活性的分析 593

基本方案1 Southern杂交检测传统凝胶电泳中末端端粒DNA限制性片段（TRF）的端粒长度 593

备选方案1尼龙膜上的Southern杂交 594

辅助方案1端粒或其他寡聚核苷酸末端标记 595

基本方案2用脉冲电场凝胶电泳法测量端粒 595

基本方案3荧光原位杂交 597

基本方案4 Q FISH 599

辅助方案2从分裂的淋巴细胞中制备分裂中期染色体 601

基本方案5端粒酶活性的测定 601

备选方案2非放射性的TRAP分析方法1：荧光染料（SYBR I）标记 604

备选方案3非放射性的TRAP分析方法2：荧光染料（TAMRA-TS）标记 604

第十五章 免疫分子与受体工程学 606

单元15.1 用MHC-Ig二聚体检测抗原特异性T细胞 607

基本方案构建MHC I-Ig二聚体 607

辅助方案1测定MHC-Ig融合蛋白浓度 610

辅助方案2 J558L转染细胞大规模培养及上清的浓缩 611

辅助方案3用5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶层析法纯化MHC-Ig二聚体 612

辅助方案4制备5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶 613

辅助方案5通过被动交换法为MHC-Ig嵌合蛋白负载多肽 614

辅助方案6碱洗脱法负载多肽 614

辅助方案7温和酸性条件下负载多肽 615

辅助方案8流式细胞分析抗原特异性T细胞 615

单元15.2 用MHC肽四聚体显现抗原特异性T细胞 616

基本方案1制备带BirA底物标签的MHC I类分子亚单位的包含体 619

基本方案2 MHC I类分子肽复合物的重新折叠 622

辅助方案1用ELISA测定MHC 623

辅助方案2用分子大小排阻层析法进行超滤和纯化以浓缩折叠蛋白 624

基本方案3用酶进行生物素化、纯化及生物素化效率的分析 625

基本方案4用链亲和素使生物素化的单体形成多聚体 628

基本方案5 用标记的MHC Ⅰ类分子四聚体通过流式细胞分析含特异性T细胞受体的细胞 629

附录1试剂与溶液 631

附录2实验用小鼠、大鼠和仓鼠 701

附录2A常用小鼠和大鼠品系 701

附录2B饲养 704

附录2C处理和捕捉 706

基本方案1小鼠的处理和捕捉 707

基本方案2大鼠的处理和捕捉 707

基本方案3仓鼠的处理和捕捉 708

备选方案啮齿类动物捕捉器 708

附录2D麻醉 709

基本方案1小鼠、大鼠和仓鼠的注射麻醉 710

基本方案2用甲氧氟烷吸入法麻醉小鼠、大鼠和仓鼠 711

附录2E腹腔注射 712

基本方案1小鼠、大鼠和仓鼠的肌肉注射 712

基本方案2小鼠、大鼠和仓鼠的皮内注射 713

基本方案3小鼠、大鼠和仓鼠的皮下注射 713

基本方案4小鼠的静脉注射 714

基本方案5小鼠、大鼠和仓鼠的腹膜内注射 715

基本方案6小鼠足垫注射 715

基本方案7小鼠胸腺内注射 715

附录2F血液收集 716

基本方案1小鼠和大鼠的眼眶或眼血管丛取血 717

基本方案2小鼠和大鼠的尾静脉微量采血管取血 717

备选方案从小鼠和大鼠的尾静脉以离心管取血 718

基本方案3小鼠腋窝丛取血 718

附录2G安乐死 719

基本方案1二氧化碳窒息 719

基本方案2过量戊巴比妥注射 719

备选方案1麻醉下放血 720

备选方案2小鼠颈椎脱臼 720

附录2H淋巴器官和胸腺的摘除 720

基本方案1小鼠淋巴器官的摘除 720

基本方案2脾切除术 722

备选方案脾半切除术 723

基本方案3新生鼠胸腺摘除 724

基本方案4成年鼠的胸腺摘除术 725

辅助方案胸腺吸入套管的制备 727

附录3免疫学常用细胞实验技术 729

附录3A细胞生长的检测 729

基本方案1血细胞计数板计数细胞 729

基本方案2库尔特粒度仪计数细胞 729

附录3B细胞冻存 730

基本方案1细胞株或杂交瘤的冻存 730

基本方案2细胞株或杂交瘤细胞的复苏 730

附录3C台盼蓝拒染试验检测细胞活力 731

基本方案 731

附录3D瑞氏-吉姆萨和非特异性酯酶染色 732

基本方案1瑞氏-吉姆萨染色通常用于淋巴细胞形态的研究 732

基本方案2非特异性酯酶染色 733

附录3E3H TdR的掺入 733

基本方案 733

附录3F判断并处理细胞培养中的支原体污染 734

基本方案1检测可能存在的支原体污染 734

基本方案2用BM-cyclin处理污染的细胞 735

备选方案用环丙沙星处理支原体污染的细胞 736

附录3G人外周血单个核细胞的分离 736

基本方案静脉穿刺采集外周血 736

备选方案 淋巴细胞去除法取血 737

附录4试剂和设备的供应商 738

参考文献 785

索引 797