分子克隆实验指南 下PDF电子书下载

上册 2

第1章 质粒及其在分子克隆中的应用 2

导言 2

SDS碱裂解法制备质粒DNA（方案1～3） 26

方案1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备 27

方案2 SDS碱裂解法制备质粒DNA：中量制备 30

方案3 SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 32

煮沸裂解法制备质粒DNA（方案4和5） 36

方案4煮沸裂解法小量制备质粒DNA 36

方案5煮沸裂解法大量制备质粒DNA 39

方案6牙签法小量制备质粒DNA 42

方案7 SDS裂解法提取质粒DNA 45

方案8聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA 48

方案9层析法纯化质粒DNA 50

方案10氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA：连续梯度法 53

方案11氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA：不连续梯度法 56

方案12用有机溶剂抽提法从DNA中除去溴化乙锭 59

方案13用离子交换层析法从DNA中去除溴化乙锭 61

方案14 NaCl离心法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸 63

方案15 Sephacryl S-1000层析法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸 65

方案16氯化锂沉淀法去除质粒DNA制备物中的小片段核酸 66

方案17在质粒载体中进行定向克隆 68

方案18在凸出末端上连接接头 71

方案19在质粒载体中进行平末端片段的克隆 73

方案20质粒DNA的去磷酸化 76

方案21 向平末端DNA连接合成接头 80

方案22在低熔点琼脂糖中连接质粒和目的DNA 85

方案23制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法：高效的转化策略 87

方案24制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞 93

方案25用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌 96

方案26大肠杆菌的电击转化 99

方案27用X-gal和IPTG筛选细菌菌落：α互补 103

替代方案：X-gal和IPTG直接用于琼脂板 105

方案28小量细菌克隆的杂交法筛选 105

方案29中等量细胞克隆的杂交法筛选 107

替代方案：菌落的快速裂解和DNA固定于尼龙膜 109

方案30大量细菌克隆的杂交方法筛选 110

方案31 菌落的裂解和DNA与滤膜的结合 112

方案32在滤膜上进行细菌DNA的杂交 114

信息栏 118

氯霉素 118

卡那霉素 120

pBR322 121

四环素 122

氨苄青霉素和羧苄青霉素 123

X-gal 124

α互补 125

溴化乙锭 126

缩合剂与聚合剂 127

聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA 128

溶菌酶 128

聚乙二醇 129

氯化铯和氯化铯平衡密度梯度 130

DNA连接酶 132

接头 136

电击转化 137

第2章 λ噬菌体及其载体 147

导言 147

方案1λ噬菌体的铺平板培养 170

附加方案：表达β-半乳糖苷酶噬菌体的噬菌斑分析 175

附加方案：大噬菌斑 176

方案2λ噬菌体噬菌斑的挑取 176

方案3通过平板裂解和洗脱制备λ噬菌体原种 177

替代方案：通过平板裂解和刮取制备λ噬菌体原种 180

方案4用小量液体培养物制备λ噬菌体原种 181

方案5λ噬菌体的大规模培养：低倍数感染 183

替代方案：λ噬菌体的大规模培养：高倍数感染 185

方案6从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒 185

方案7通过凝胶电泳测定λ噬菌体原种和裂解物中DNA的含量 187

方案8通过CsCl等密度梯度离心纯化λ噬菌体颗粒 189

替代方案：通过CsCl平衡梯度等密度离心纯化λ噬菌体颗粒 192

方案9通过甘油分级梯度离心纯化λ噬菌体颗粒 193

方案10通过沉淀／离心纯化λ噬菌体颗粒 194

方案11用蛋白酶K和SDS从大规模培养物中提取λ噬菌体DNA 195

方案12用甲酰胺从大规模培养物中提取λ噬菌体DNA 198

方案13可被单一限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备 200

方案14经双限制酶切割用作克隆载体的λ噬菌体DNA的制备 202

方案15λ噬菌体载体DNA的碱性磷酸酶处理 206

方案16λ噬菌体臂的纯化：通过蔗糖密度梯度离心 209

方案17用于基因组文库中的真核DNA的部分酶切：预反应 213

方案18用于基因组文库的真核DNA的部分酶切：制备反应 216

方案19λ噬菌体臂与外源基因组DNA片段的连接 219

方案20基因组文库的扩增 222

方案21噬菌体DNA从噬菌斑到膜的转移 224

替代方案：从噬菌斑到滤膜的快速转移 229

方案22噬菌体DNA在滤膜上的杂交 229

方案23λ噬菌体分离物的快速分析：从平板裂解物中纯化λDNA 233

附加方案：通过CTAB沉淀除去多糖 238

方案24λ噬菌体分离物的快速分析：从液体培养物中纯化λDNA 238

信息栏 241

噬菌体：历史回顾 241

将对DNA大分子的损伤减少到最低程度 242

体外包装 243

第3章 M13噬菌体载体 251

导言 251

方案1 M13噬菌体铺平板 266

方案2 M13噬菌体液体培养 268

方案3 M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备 270

方案4 M13噬菌体单链DNA的制备 273

方案5单链和双链M13噬菌体DNA的大规模制备 276

方案6 M13噬菌体载体的克隆 278

方案7重组M13噬菌体克隆分析 284

替代方案：杂交法筛选M13噬菌体噬菌斑 286

方案8用噬菌粒载体制备单链DNA 286

信息栏 292

生长时间 292

聚乙二醇 293

第4章 高容量载体的应用 297

导言 297

方案1应用黏粒载体构建基因组DNA文库 307

方案2通过杂交筛选未扩增的黏粒文库：滤膜影印 320

附加方案：减少交叉杂交 322

方案3黏粒文库的扩增和贮存：在液体培养基内扩增 323

方案4黏粒文库的扩增和贮存：在滤膜上扩增 325

替代方案：在平板上扩增 328

方案5 P1噬菌体及其克隆系统的应用 328

附加方案：用点滴透析法纯化高分子质量DNA 337

替代方案：用Qiagen树脂层析纯化高分子质量环状DNA 337

方案6 P1噬菌体克隆在大肠杆菌宿主间的转移 338

方案7细菌人工染色体的应用 340

方案8从小量培养物中分离BAC DNA 345

方案9从大量培养物中分离BAC DNA 347

方案10酵母人工染色体的应用 350

方案11酿酒酵母的生长及其DNA的制备 359

方案12酵母DNA的小量制备 361

方案13利用PCR分析酵母菌落 361

方案14高容量载体中基因组DNA片段末端的分离：小载体PCR 365

信息栏 373

Cre-loxP 373

大片段克隆产品及其服务 377

第5章 DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳 385

导言 385

方案1琼脂糖凝胶电泳 387

方案2琼脂糖凝胶中DNA的检测 396

方案3琼脂糖凝胶中DNA的回收：DEAE-纤维素膜电泳 400

方案4琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收：电洗脱至透析袋 404

方案5阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA 406

方案6低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提 408

替代方案：用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA 411

方案7低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：用琼脂糖酶消化 412

方案8碱性琼脂糖凝胶电泳 414

附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影 417

方案9中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 418

方案10聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测 424

方案11聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测 425

方案12聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法 426

脉冲场凝胶电泳（方案13～20） 429

方案13脉冲场凝胶电泳制备DNA：哺乳动物细胞和组织DNA的分离 435

方案14脉冲场凝胶电泳制备DNA：酵母完整DNA的分离 438

方案15琼脂糖凝胶栓中DNA的限制性内切核酸酶消化 441

方案16脉冲场凝胶电泳的分子质量标准 444

方案17横向交变场的脉冲场凝胶电泳 446

替代方案：PFGE凝胶的银染 449

方案18箝位匀强电场的脉冲场凝胶电泳 450

方案19脉冲场凝胶中DNA片段的直接回收 454

方案20脉冲场凝胶中浓缩DNA片段的回收 455

第6章 真核基因组DNA的制备和分析 461

导言 461

方案1 用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA 463

附加方案：用荧光计估计DNA的浓度 470

方案2用甲酰胺从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA 471

方案3用缠绕法从哺乳动物细胞中分离DNA 474

方案4从96孔微培养板生长的哺乳动物细胞中分离DNA 476

附加方案：适用于PCR的优化基因组DNA分离 478

方案5从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA 479

替代方案：不用有机溶剂从鼠尾分离DNA 482

替代方案：一管法从鼠尾中分离DNA 482

替代方案：从石蜡块中提取DNA 483

方案6哺乳动物DNA的快速分离 483

方案7酵母DNA的快速分离 485

方案8、9、10的导言 487

方案8 Southern印迹：毛细管法将DNA转移到膜上 492

方案9 Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶上同时向两张膜转移 499

方案10放射性标记的探针与固定在膜上的核酸的Southern杂交 502

附加方案：从膜上洗去探针 508

附加方案：低严谨性杂交 509

信息栏 509

甲酰胺及其在分子克隆中的应用 509

缠绕DNA（历史注脚） 511

快速杂交缓冲液 512

CTAB 512

第7章 真核细胞mRNA的提取、纯化和分析 516

导言 516

方案1用酸性酚-硫氰酸胍-氯仿提取法纯化组织和细胞中的RNA 518

方案2用一步法从细胞和组织中同时制备DNA、RNA和蛋白质 522

方案3 oligo（dT）-纤维素层析法提取poly（A）＋RNA 525

方案4批量层析方法筛选poly（A）＋RNA 529

Northern杂交 532

方案5根据大小分离RNA：乙二醛化RNA的琼脂糖凝胶电泳 537

方案6按大小分离RNA：在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA的电泳 540

方案7变性RNA在膜上的转移和固定 544

替代方案：下行毛细管转移 548

方案8 Northern杂交 549

方案9纯化的RNA的点杂交和狭线杂交 552

方案10用S1核酸酶对RNA作图 556

方案11 核糖核酸酶保护：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图 567

方案12用引物延伸法进行RNA的分析 577

信息栏 582

如何去除RNA酶 582

RNA酶的抑制剂 583

DEPC（焦碳酸二乙酯） 584

胍盐 585

核酸酶S1 586

外切核酸酶Ⅶ 586

绿豆核酸酶 587

噬菌体编码的RNA聚合酶识别的启动子序列 587

放线菌素D 588

第8章 聚合酶链式反应体外扩增DNA 597

导言 597

方案1聚合酶链式反应 611

方案2制备克隆用PCR产物的纯化 618

方案3通过超滤去除DNA扩增产物中的寡核苷酸及过剩dNTP 620

克隆PCR产物的导言（方案4～7） 622

方案4 PCR产物的平末端克隆 624

方案5克隆化的PCR产物连入T载体 627

方案6通过PCR扩增在扩增DNA产物末端引入限制性核酸内切酶酶切位点 628

方案7应用PCR的遗传工程 633

方案8 应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR） 636

方案9 cDNA 5′末端的快速扩增（5′-RACE） 644

方案10 cDNA 3′末端的快速扩增（3′-RACE） 651

方案11应用混合寡核苷酸引物引导的cDNA扩增（MOPAC） 657

方案12克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定 663

附加方案：用PCR方法筛选酵母转化子 666

附加方案：筛选λ噬菌体文库 666

方案13长距离PCR 667

方案14反向PCR 671

方案15定量PCR 676

方案16差异显示PCR 687

信息栏 698

多重PCR 698

TaqDNA聚合酶 700

热启动PCR 701

第9章 放射性标记DNA探针与RNA探针的制备 719

导言 719

方案1随机引物法：利用寡核苷酸延伸法进行纯化DNA片段的放射性标记 721

方案2随机引物法：在融化琼脂糖存在下利用随机寡核苷酸延伸进行DNA的放射标记 725

方案3利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针 730

附加方案：不对称探针 733

方案4从M13噬菌体模板合成固定长度的单链DNA探针 734

方案5从M13噬菌体模板合成非固定长度的单链DNA探针 739

方案6体外转录合成单链RNA探针 742

附加方案：用PCR法将噬菌体编码的RNA聚合酶启动子加至DNA片段上 749

方案7用随机寡核苷酸引物从mRNA合成cDNA探针 750

方案8用寡聚（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针 753

方案9用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记 757

方案10 用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3′端 761

方案11 用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3′端 767

方案12 用［α-32P］3′脱氧腺苷5′-三磷酸或［α-32P］双脱氧ATP末端标记双链DNA的3′突出端 770

方案13用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化 771

方案14含5′突出羟基端的DNA分子磷酸化 774

方案15去磷酸化的平端或5′凹端DNA分子的磷酸化 778

方案16用交换反应进行5′突出端DNA分子的磷酸化 780

信息栏 782

核酸的非放射性标记 782

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 788

体外转录系统 794

通过差异筛选和克隆分离差异表达的cDNA 796

碱性磷酸酶 800

第10章 合成寡核苷酸探针 811

导言 811

方案1用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化合成的寡核苷酸 820

方案2寡核苷酸5′末端磷酸化 825

方案3乙醇沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸 827

方案4 CPB沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸 828

方案5大小排阻层析法纯化放射性标记的寡核苷酸 830

方案6用Sep-Pak C18柱层析法纯化放射性标记的寡核苷酸 833

方案7用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段标记合成的寡核苷酸 834

方案8寡核苷酸探针在溶液中的杂交：用含季铵盐的缓冲液洗涤 838

方案9解链温度的实验测定 841

信息栏 845

寡核苷酸的合成 845

解链温度 849

纯化合成寡核苷酸的方法 851

第11章 cDNA文库制备及基因鉴定 857

导言 857

方案1 cDNA文库的构建 889

阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链 890

阶段2：cDNA第二链的合成 894

阶段3：cDNA的甲基化 898

阶段4：与接头或衔接子相连接 901

阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤分离cDNA 906

阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接 909

替代方案：cDNA与质粒载体的连接 913

附加方案：cDNA文库的扩增 914

方案2真核表达文库的构建与筛选 917

阶段1：在真核表达载体上构建cDNA文库 917

阶段2：在真核表达载体上构建的cDNA文库的筛选 922

方案3外显子捕获与扩增 927

阶段1：文库的构建 929

阶段2：电穿孔法将文库转染COS-7细胞 932

阶段3：mRNA的提取 934

阶段4：反转录PCR 936

阶段5：克隆分析 942

方案4用大片段基因组DNA克隆直接筛选cDNA 944

信息栏 953

商品化的cDNA合成与文库构建试剂盒 953

Mo-MLV反转录酶 955

同聚物加尾 956

λgt10和λgt11 957

少量细胞制备cDNA文库 958

体外包装 959

COS细胞 960

生物素 961

磁珠 965

不依赖连接的克隆 967

下册 981

第12章 DNA测序 981

导言 981

方案1建立随机重叠DNA插入文库 986

替代方案：M13噬菌体小量单链DNA模板制备 998

附加方案：随机克隆用去磷酸化平末端M13噬菌体载体DNA制备 999

方案2双脱氧链终止法测序用变性模板的制备 1000

附加方案：双链DNA的快速变性 1003

附加方案：聚乙二醇沉淀法小量纯化质粒DNA 1004

方案3用T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）进行双脱氧测序反应 1005

方案4 用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段及单链DNA模板进行双脱氧测序 1011

方案5用Taq DNA聚合酶进行双脱氧测序反应 1015

方案6循环测序：利用PCR和引物末端标记进行双脱氧测序 1020

附加方案：使用PCR和［α-32P］dNTP内部标记进行的循环测序反应 1027

方案7化学测序法 1028

替代方案：快速Maxam-Gilbert测序法 1036

附加方案：制备化学测序中的末端标记DNA 1038

方案8变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 1039

方案9含甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶的制备 1044

方案10配制电解质梯度胶 1046

方案11 上样并进行DNA测序 1047

方案12放射自显影和从测序凝胶上读取DNA序列 1051

信息栏 1054

自动化DNA测序 1054

微量滴定板 1061

E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段 1062

用于测序的寡核苷酸引物的贮存液的制备 1064

测序酶 1065

使用PCR扩增DNA进行传统的链终止测序 1067

用于DNA测序的dNTPs和ddNTPs贮存液的制备 1068

DNA序列测定中的甘油 1069

在DNA测序凝胶中的压缩现象 1069

7-脱氮-dGTP 1071

二氯二甲基硅烷 1072

阅读放射自显影相片 1072

DNA的电泳迁移率 1073

第13章 诱变 1080

导言 1080

方案1含尿嘧啶的单链噬菌体M13 DNA制备 1088

方案2寡核苷酸指导的单链DNA诱变 1091

方案3 以双链DNA为模板的体外诱变：用DpnⅠ选择突变体 1095

方案4通过单一限制位点消除进行寡核苷酸指导的诱变（USE诱变） 1101

方案5利用大引物PCR在同一试管中进行高效快速定点诱变 1105

方案6重叠延伸产生特异位点诱变 1109

方案7用放射性标记的寡核苷酸杂交筛选定点诱变重组克隆 1113

替代方案：放射性标记的寡核苷酸杂交筛选含噬菌粒的细菌克隆 1118

替代方案：PCR方法检测确定的突变体 1119

方案8单链构象多态性和异源双链分析方法检测突变 1119

方案9外切核酸酶Ⅲ消化产生多组嵌套缺失突变体 1127

方案10 BAL 31核酸酶消化法产生双向缺失突变体 1131

信息栏 1135

BAL31 1135

外切核酸酶Ⅲ 1140

接头分区诱变 1143

随机诱变 1144

丙氨酸扫描诱变 1148

诱变寡核苷酸 1149

排除野生型DNA的定点诱变筛选 1151

N6-甲基化腺嘌呤，DAM甲基化酶和甲基化敏感限制酶 1154

定点突变的商业试剂盒 1156

甘油 1156

突变检测 1158

第14章 表达文库的筛选 1172

导言 1172

方案1筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库 1175

方案2筛选质粒载体构建表达的文库 1183

方案3去除抗血清中交叉反应的抗体：假筛选 1190

替代方案：用噬菌体感染细胞裂解液吸收抗体 1192

方案4从抗血清中去除交叉反应性抗体：与大肠杆菌裂解液共同温育 1192

方案5从抗血清中去除交叉反应性抗体：亲和层析法 1194

方案6利用λ噬菌体文库筛选DNA结合蛋白 1196

方案7制备含有由λ噬菌体溶源菌所编码融合蛋白质的裂解液：细菌克隆的溶解 1201

方案8含有λ噬菌体编码融合蛋白质裂解液的制备：琼脂板上裂解性感染 1205

方案9含有λ噬菌体编码融合蛋白裂解液的制备：液体培养液中裂解感染 1207

信息栏 1209

质粒及λ噬菌体表达载体 1209

基因组DNA和cDNA表达文库 1211

抗体在免疫筛选中的应用 1212

第15章 在大肠杆菌中表达克隆化基因 1217

导言 1217

方案1用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 1228

方案2用T7噬菌体启动子在大肠杆菌中表达克隆基因 1232

方案3用λ噬菌体PL启动子在大肠杆菌中表达克隆基因 1236

方案4用碱性磷酸酶启动子（phoA）和信号序列在大肠杆菌中分泌表达外源蛋白 1241

附加方案：PhoA融合蛋白的亚细胞定位 1244

方案5谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白 1245

方案6直链淀粉树脂亲和层析纯化麦芽糖结合融合蛋白 1248

方案7用固化Ni2＋吸收色谱纯化带组氨酸标签的蛋白 1252

替代方案：用pH递降的缓冲液从金属亲和柱洗脱多聚组氨酸标签蛋白 1255

附加方案：NTA-Ni2＋-琼脂糖再生 1255

方案8从包涵体中纯化表达蛋白 1256

附加方案：重折叠从包涵体提取的溶解蛋白 1259

信息栏 1260

克隆基因的表达 1260

大肠杆菌表达系统 1261

LacZ融合 1263

离液剂 1265

第16章 哺乳动物培养细胞中导入克隆化基因 1271

导言 1271

方案1脂染介导的DNA转染 1276

附加方案：单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶 1282

方案2磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 1282

替代方案：高效率的磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 1286

方案3磷酸钙介导的高分子量基因组DNA转染细胞 1287

替代方案：磷酸钙介导的贴壁细胞的转染 1290

替代方案：磷酸钙介导的悬浮细胞的转染 1291

方案4 DEAE-葡聚糖介导的高效率转染 1291

替代方案：DEAE介导的转染：增强细胞生存力 1295

方案5电穿孔转染DNA 1296

方案6生物粒子介导的DNA转染 1299

附加方案：单层细胞组化染色鉴定β-葡萄糖醛酸酶 1303

方案7利用Polybrene进行DNA转染 1303

信息栏 1306

共转化 1306

稳定转染的筛选试剂 1307

脂染 1309

磷酸钙-DNA沉淀物转染哺乳动物细胞 1311

二磷酸氯喹 1312

电穿孔 1313

第17章 哺乳动物培养细胞的基因表达分析 1322

导言 1322

方案1 DNA酶Ⅰ足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图 1323

替代方案：羟自由基足迹法对DNA上的蛋白质结合位点作图 1331

方案2 DNA结合蛋白的凝胶阻滞分析 1332

附加方案：超迁移分析 1335

附加方案：竞争分析 1336

方案3 DNA酶Ⅰ超敏感位点作图 1336

方案4连缀转录分析 1341

报道分子测定：CAT、萤光素酶和β-半乳糖苷酶（方案5、6和7的导言） 1347

方案5薄层层析法测定哺乳动物细胞提取物中氯霉素乙酰基转移酶含量 1350

替代方案：有机溶剂萃取法测量CAT 1356

替代方案：通过把反应产物分散到闪烁液的方法测量CAT 1356

方案6哺乳动物细胞抽提物中萤光素酶的测定 1357

替代方案：用闪烁计数器测量萤光素酶活性 1361

替代方案：测量96孔板上培养细胞的萤光素酶活性 1361

方案7哺乳动物细胞提取物中β半乳糖苷酶的测定 1362

方案8四环素作为哺乳动物细胞中可诱导基因表达的调控物 1366

阶段1：pTet-tTAk稳定转染成纤维细胞 1373

阶段2：四环素调控的靶基因稳定转染可诱导表达tTA的NIH-3T3细胞 1378

阶段3：分析转染细胞中的蛋白质表达 1381

替代方案：用tTA自调控系统在瞬时转染细胞中进行四环素调控的基因诱导表达 1383

方案9蜕皮激素作为调控物诱导哺乳动物细胞中的基因表达 1384

信息栏 1388

DNA足迹法 1388

凝胶阻滞分析 1392

杆状病毒和杆状病毒表达系统 1395

绿色荧光蛋白 1399

抗原表位标记 1405

氯霉素乙酰基转移酶 1409

萤光素酶 1412

β半乳糖苷酶 1413

第18章 蛋白质相互作用研究技术 1428

导言 1428

方案1双杂交和其他双成分系统 1431

第一阶段诱饵-LexA融合蛋白的鉴定 1442

替代方案：通过氯仿覆盖分析β-半乳糖苷酶活性 1454

第二阶段筛选一个相互作用子 1455

第三阶段 阳性相互作用的再次确定 1464

替代方案：相互作用陷阱阳性克隆的快速筛选 1473

方案2用GST融合蛋白进行Far Western印迹来检测蛋白质蛋白质相互作用 1474

附加方案：膜结合蛋白的再折叠 1480

替代方案：用抗GST抗体检测蛋白质蛋白质相互作用 1480

方案3用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 1481

方案4通过免疫共沉淀确定结合蛋白 1486

方案5采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用 1495

第一阶段用荧光染料标记蛋白质 1506

第二阶段FLIM-FRET分析的细胞制备 1510

替代方案：FILM-FRET分析时固定细胞的制备 1512

替代方案：活细胞的微注射 1513

第三阶段F LIM-FRET测量 1515

方案6利用BIAcore通过表面等离子共振光谱学分析蛋白质的相互作用 1520

第一阶段捕获表面的制备和结合活性测试 1527

第二阶段抗原抗体相互作用的动力学分析 1531

信息栏 1539

丝状噬菌体展示 1539

基因组学和相互作用陷阱 1548

相互作用陷阱和相关技术 1550

附 录 1564

附录1分子克隆中使用的缓冲液和试剂的配制 1564

附录2培养基 1595

附录3载体和细菌菌株 1605

附录4分子克隆所用的酶 1616

附录5酶的抑制物 1659

附录6核酸 1661

附录7密码子和氨基酸 1673

附录8分子克隆中的常用技术 1681

附录9检测系统 1727

附录10 DNA阵列技术 1775

附录11生物信息学 1796

附录12告诫 1820

附录13供应商 1835

附录14商标 1836

索引 1859

编辑致谢 1950