生命科学实验指南系列 典藏版 精编蛋白质科学指南PDF电子书下载

第1章 蛋白质纯化和定性的策略 1

1.1 单元蛋白质纯化和定性概述 1

目标和研究对象 1

蛋白质纯化的原料 2

蛋白质的检测和分析 3

蛋白质分离和纯化方法 3

蛋白质产物的定性 4

蛋白质纯化实验室 5

1.2 单元蛋白质纯化流程图 6

可溶性重组蛋白 6

不可溶性重组蛋白 7

可溶性非重组蛋白 8

膜相关的和不可溶性重组蛋白 10

第2章 计算分析 12

2.1 单元用于蛋白质序列分析的疏水分布图 12

方法学 13

应用 14

结论 16

2.2 单元蛋白质二级结构预测 17

二级结构预测的方法 17

二级结构预测方法的应用 20

2.3 单元使用BLAST程序家族进行序列相似性搜索 22

进入BLAST程序和文档 22

BLAST介绍 22

BLAST程序 24

2.4 单元因特网上的蛋白质数据库 27

蛋白质结构数据库 28

蛋白质家族数据库 29

2.5 单元蛋白质三级结构预测 30

同源性建模 31

序列分布图法 32

线程法 33

从头结构预测 33

2.6 单元蛋白质三级结构建模 34

词汇 34

进入SwissModel程序和文档 34

ExPDB数据库 35

创建首次法建模查询的格式 35

观看SwissModel结果 36

2.7 单元比较蛋白质结构预测 36

比较建模的步骤 36

第3章 检测和分析方法 41

3.1 单元分光光度法确定蛋白质浓度 42

基本方案1计算一个蛋白质的摩尔吸收系数 42

基本方案2折叠蛋白质摩尔吸收系数的测定 42

基本方案3使用摩尔吸收系数通过吸收光谱测定蛋白质的浓度 43

基本方案4通过205 nm处的吸收光谱测定蛋白质的浓度 43

基本方案5粗蛋白质提取液总蛋白质浓度的测定 44

3.2 单元定量氨基酸分析 45

样品制备 45

平均组成的计算 45

3.3 单元肽和蛋白质的体外放射标记 47

基本方案1使用碘珠对酪氨酸或组氨酸残基进行碘化 47

备择方案1用氯胺T或Iodogen在酪氨酸或组氨酸残基碘化 49

备择方案2使用乳酸过氧化物酶在酪氨酸或组氨酸残基碘化 49

辅助方案1等摩尔碘化以获得产物的高收率 50

辅助方案2用HPLC从碘化产物中分离未标记的肽 50

基本方案2用Bolton-Hunter试剂在赖氨酸残基或N端碘化 51

基本方案3通过酸酐乙酰化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记 52

备择方案3通过还原性烷基化在赖氨酸残基或N端进行14C或3H标记 53

备择方案4用碘乙酸或碘乙酰胺在赖氨酸残基进行14C或3H标记 54

基本方案4在肽合成过程中引入标记的氨基酸残基 54

备择方案5在肽合成过程中在N端进行选择性标记 55

3.4 单元总蛋白质的分析 56

基本方案1总蛋白质定量的双缩脲分析 57

基本方案2总蛋白质定量的Hartree-Lowry分析 57

基本方案3总蛋白质定量的二喹啉甲酸（BCA）分析 58

基本方案4总蛋白质定量的酸消化——茚三酮法 58

辅助方案1热封玻璃管 59

基本方案5测量总蛋白质的考马斯染料结合分析（Bradford分析） 60

辅助方案2蛋白质样品的凝胶透析 60

辅助方案3蛋白质样品的三氯醋酸沉淀 61

3.5 单元溶液中和细胞表面上蛋白质的生物素化 62

基本方案1将生物素共价连接到赖氨酸上 62

基本方案2将生物素共价连接到巯基上 63

辅助方案1二硫键的还原 64

辅助方案2生物素化蛋白质的检测 64

3.6 单元用氨基酸进行代谢标记 65

基本方案用［35S］甲硫氨酸对悬浮细胞进行脉冲标记 65

备择方案1用［35S］甲硫氨酸对贴壁细胞进行脉冲标记 66

备择方案2用［35S］甲硫氨酸对细胞进行脉冲追踪标记 67

备择方案3用［35S］甲硫氨酸对细胞进行长期标记 67

辅助方案用TCA沉淀确定标记掺入 67

第4章 提取、稳定和浓缩 69

4.1 单元用透析和超滤法脱盐、浓缩和更换缓冲液 69

基本方案1用再生纤维素透析袋进行脱盐、浓缩和更换缓冲液 69

基本方案2用不对称圆盘膜超滤进行浓缩或透析 71

备择方案1用切向流超滤进行渗滤或浓缩 73

备择方案2用离心式超滤器进行微量浓缩和脱盐 74

4.2 单元蛋白质的选择性沉淀 75

策略设计 75

基本方案1用盐析选择性沉淀 76

备择方案1用分步盐析选择性沉淀 78

基本方案2用等离子沉淀选择性沉淀：柱法 78

备择方案2用等离子沉淀选择性沉淀：透析法 80

基本方案3使用C4和C5有机共溶剂选择性沉淀 80

基本方案4使用蛋白质排阻和拥挤剂及渗透物选择性沉淀 81

基本方案5使用合成的和半合成的聚合电解质选择性沉淀 82

基本方案6使用金属和多酚杂多阴离子选择性沉淀 83

4.3 单元蛋白质的长期保存 84

蛋白质聚集 84

化学降解 85

在不冻的水溶液中保存 85

以盐析沉淀物的形式保存 86

以冻结溶液的形式保存 86

以冻干固体的形式保存 87

选择适当的保存方法 89

蛋白酶的抑制 89

第5章 重组蛋白的生产 90

5.1 单元在大肠杆菌中生产重组蛋白 91

5.2 单元大肠杆菌表达系统的选择 92

基本方案1在pL启动子控制下的表达：温度诱导 94

基本方案2在trp启动子控制下的表达：化学诱导 94

备择方案1在lac/tac启动子控制下的表达 95

备择方案2 T7 RNA聚合酶／启动子表达系统 95

辅助方案1菌株保存 96

辅助方案2 SDS-PAGE分析样品的制备 96

辅助方案3可溶性分析 97

辅助方案4周质提取物的制备 97

辅助方案5细胞外培养基样品的制备 98

5.3 单元最适宜于蛋白质生产的大肠杆菌的发酵和生长 99

基本方案以分批发酵的方式生产重组蛋白 99

备择方案1用重金属衍生物进行重组蛋白的体内标记 101

备择方案2重组蛋白的稳定同位素标记 102

辅助方案1监测生长 103

辅助方案2检查无菌度 103

5.4 单元在杆状病毒系统中的蛋白质表达 103

基本方案1病毒贮液的大规模生产 104

基本方案2表达动力学的确定 105

基本方案3在生物反应器中生产 106

备择方案用灌注培养生产 107

辅助方案收获 108

5.5 单元用于生产外源蛋白质的酵母培养 108

基本方案1使用酿酒酵母半乳糖调控的载体小规模表达 109

备择方案1使用葡萄糖阻抑型ADH2载体表达 110

备择方案2使用带糖酵解基因启动子的载体表达 110

基本方案2在巴斯德毕赤酵母中小规模表达 111

辅助方案蛋白质提取物的小规模制备 112

5.6 单元哺乳动物细胞蛋白质表达的概况 113

5.7 单元在哺乳动物细胞中生产重组蛋白 115

基本方案1用碱裂解／阴离子交换捕获法纯化质粒 116

基本方案2用脂质体转染法转染细胞 117

基本方案3用遗传霉素（G418）进行新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）的选择 118

辅助方案对G418背景敏感性的确定 119

基本方案4用氨甲蝶呤（MTX）扩增二氢叶酸还原酶（DHFR） 119

基本方案5通过多次传代使悬浮细胞适应生产培养基 120

基本方案6细胞在大规模转瓶中以分批的方式生长 122

基本方案7细胞在大规模分批反应器中的生长 124

备择方案在生物反应器中连续培养细胞的生长 125

基本方案8从转瓶培养物和大规模反应器中收获分泌的产物 126

基本方案9从转瓶培养物的大规模反应器中收获与细胞相关的产物 128

5.8 单元细胞培养物和痘病毒贮液的制备 128

基本方案1单层细胞的培养 129

基本方案2悬浮细胞的培养 130

基本方案3痘病毒贮液的制备 131

5.9 单元重组痘病毒的构建 132

基本方案1用痘病毒载体转染痘病毒感染的细胞 133

基本方案2重组病毒噬斑的选择和筛选 136

基本方案3噬斑的扩增 138

5.10 单元细胞蛋白质表达系统的选择 139

5.11 单元使用Gateway系统在多种宿主中进行蛋白质表达 143

第6章 重组蛋白的纯化 147

6.1 单元在大肠杆菌中生产的重组蛋白的纯化概述 149

确定溶解度 150

蛋白质定位 151

分离可溶性蛋白质 153

分离不可溶性蛋白质 153

6.2 单元从大肠杆菌中制备可溶性蛋白质 155

基本方案在大肠杆菌中可溶性表达的一种蛋白质：白细胞介素1β的纯化 156

6.3 单元从大肠杆菌中制备和提取不溶性（包含体）蛋白质 161

基本方案1从大肠杆菌中制备和提取不溶性（包含体）蛋白质 161

基本方案2在盐酸胍存在的情况下进行中压凝胶过滤层析 162

6.4 单元蛋白质折叠概述 164

蛋白质是怎样折叠的 164

怎样折叠蛋白质 166

6.5 单元大肠杆菌不溶性（包含体）蛋白质的折叠和纯化 170

基本方案1牛生长激素的折叠和纯化 170

基本方案2人白细胞介素2的折叠和纯化 173

基本方案3带组氨酸标签蛋白质的折叠和纯化：HIV-1整合酶 174

6.6 单元GST融合蛋白的表达和纯化 177

基本方案1谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的表达 178

基本方案2可溶性GST融合蛋白的亲和层析纯化 179

备择方案用亲和层析从包含体中纯化GST融合蛋白 181

基本方案3蛋白酶切割融合蛋白溶液以除去GST亲和标签 181

6.7 单元硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 182

基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 182

辅助方案硫氧还蛋白融合蛋白的渗透压释放 185

第7章 重组蛋白的定性 186

7.1 单元重组蛋白定性概述 188

7.2 单元用紫外吸收光谱法测定重组蛋白的一致性和纯度 190

基本方案用近紫外光谱法分析蛋白质 190

7.3 单元测定重组蛋白的一致性和结构 194

基本方案测定重组蛋白的二硫键模式 194

7.4 单元横向尿素梯度电泳 197

基本方案 197

7.5 单元分析型超速离心 200

7.6 单元测定蛋白质的圆二色谱 201

基本方案记录CD谱 203

辅助方案远紫外CD谱的解释 205

7.7 单元测定蛋白质的荧光光谱法 205

基本方案记录荧光发射光谱 207

7.8 单元用差示扫描量热法测量蛋白质的热稳定性 209

基本方案差示扫描量热法 209

辅助方案1电校准 211

辅助方案2用碳氢化合物胶囊进行温度校准 211

辅助方案3用脂悬液进行温度校准 211

辅助方案4 DSC比色杯的维护和清洁 211

7.9 单元用HPLC凝胶过滤和质谱法对蛋白质进行定性 212

策略设计 212

基本方案重组蛋白的HPLC分析 214

辅助方案重组蛋白的MALDI-MS分析 215

第8章 常规层析分离 217

8.1 单元常规层析概述 217

目的蛋白的收率和纯度 217

纯化策略的步骤 219

影响层析分辨率的参数 220

8.2 单元离子交换层析 224

策略设计 224

基本方案1批量吸附和逐步提高盐浓度的梯度洗脱 227

备择方案基于pH的分步梯度洗脱 228

基本方案2线性梯度洗脱的柱层析 229

辅助方案1用试管预试验确定离子交换层析的起始条件 230

辅助方案2离子交换柱动态（柱）容量和处理容量的测量 232

辅助方案3梯度形成技术 232

辅助方案4离子交换介质的清洗和再生 233

辅助方案5离子交换介质的保存 233

8.3 单元凝胶过滤层析 234

策略设计 234

基本方案1脱盐（分组分离） 235

基本方案2蛋白质分级分离 239

基本方案3测定分子大小 239

备择方案柱校准 240

8.4 单元疏水相互作用层析 241

策略设计 241

基本方案1用胶珠≥90 μm的HIC介质装柱 243

备择方案用胶珠≤34μm的HIC介质装柱 244

基本方案2测试装填的柱床 244

基本方案3从HIC柱上洗脱蛋白质 246

辅助方案HIC柱的再生、清洁和贮存 246

8.5 单元肽和蛋白质的HPLC 248

启动程序 248

HP-SEC的标准操作条件 253

HP-NPC的标准操作条件 253

HP-HIC的标准操作条件 254

HP-IEX的标准操作条件 254

H P-HILIC的标准操作条件 255

H P-IMAC的标准操作条件 256

H P-BAC的标准操作条件 256

RP-HPLC的标准操作条件 257

用RP-HPLC技术对肽和蛋白质混合物进行脱盐处理 259

RP-HPLC方法的建立 259

第9章 亲和层析 261

9.1 单元凝集素亲和层析 263

基本方案Con A-Sepharose亲和层析 263

辅助方案确定凝集素结合和洗脱条件的预实验 265

备择方案麦胚凝集素（WGA）-Agarose亲和层析 266

9.2 单元染料亲和层析 266

基本方案1用层析法选择各成分 266

基本方案2阴性层析 268

基本方案3使用分步洗脱的阳性层析 269

辅助方案活性染料的固定化 269

9.3 单元天然配体的亲和纯化 271

基本方案CNBr活化 271

备择方案1用对硝基苯基氯甲酸酯活化 273

备择方案2用2，2，2-三氟乙烷基磺酰氯活化 274

9.4 单元金属螯合亲和层析（MCAC） 275

策略设计 275

基本方案用于纯化可溶性带组氨酸尾融合蛋白的非变性MCAC 275

备择方案1用于纯化不溶性带组氨酸尾的融合蛋白的变性MCAC 277

备择方案2 MCAC纯化后蛋白质的固相复性 278

辅助方案1纯化后蛋白质的分析和处理 279

辅助方案2 NTA树脂的再生 279

9.5 单元免疫亲和层析 280

基本方案可溶性或膜结合抗原的分离 280

备择方案1抗原的低pH洗脱 282

备择方案2抗原的批量纯化 282

备择方案3辛基β-D-葡萄糖苷的洗脱 283

辅助方案抗体-Sepharose的制备 283

9.6 单元免疫沉淀 284

基本方案1用非变性去污剂溶液裂解的细胞悬液进行免疫沉淀 284

基本方案2免疫沉淀再捕获 289

第10章 电泳 291

10.1 单元蛋白质的单向SDS凝胶电泳 292

电流和电泳 292

基本方案变性（SDS）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：Laemmli法 294

备择方案1在Tris-Tricine缓冲液系统中电泳 297

备择方案2在梯度凝胶中分离蛋白质 298

辅助方案灌制多块梯度胶 301

10.2 单元非变性条件的单向凝胶电泳 303

基本方案非变性连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 303

备择方案非变性不连续电泳和分子质量标准曲线（Ferguson曲线）的制作 307

10.3 单元双向凝胶电泳 309

基本方案1应用固相pH梯度凝胶条进行等电聚焦 309

基本方案2 IPG凝胶的第二向电泳 312

备择方案对角线凝胶电泳（非还原／还原凝胶） 313

10.4 单元利用固定法检测凝胶中的蛋白质 314

基本方案1考马斯亮蓝R-250染色 315

备择方案1快速考马斯亮蓝G-250染色 316

备择方案2酸性考马斯亮蓝G-250染色 317

基本方案2 SYPRO Ruby染色 317

基本方案3银染 318

备择方案3非氨盐银染 319

备择方案4快速银染 320

辅助方案凝胶成像 321

10.5 单元聚丙烯酰胺凝胶电印迹 322

基本方案电印迹到PVDF膜上 322

备择方案1用于序列分析的蛋白质电印迹 324

备择方案2电印迹至硝酸纤维素膜上 325

备择方案3在半干系统中的蛋白质电印迹 325

10.6 单元检测印迹膜上的蛋白质 327

基本方案1氨基黑染色 327

基本方案2考马斯亮蓝R-250染色 328

基本方案3丽春红S染色 328

基本方案4胶体金染色 329

基本方案5胶体银染色 329

基本方案6印度墨汁染色 330

基本方案7荧光胺标记 330

10.7 单元免疫印迹检测 331

基本方案使用直接耦联的第二抗体进行免疫探测 331

备择方案用耦联到第二抗体上的抗生物素蛋白生物素进行免疫探测 332

辅助方案1用发色底物显迹 333

辅助方案2用发光底物显迹 334

第11章 化学分析 336

11.1 单元溶液中蛋白质的酶解 336

基本方案非变性条件下的蛋白质消化 336

备择方案1尿素或盐酸胍溶液中的蛋白质消化 339

备择方案2 SDS溶液中的蛋白质消化 340

辅助方案1酶贮液的制备和使用 341

辅助方案2消化混合物中肽的还原和S-烷基化 344

11.2 单元在PVDF膜上酶解蛋白质 345

基本方案在氢化Triton X-100缓冲液中消化结合在PVDF膜上的蛋白质 345

11.3 单元测序用蛋白质的胶中消化 347

基本方案在含Tween 20的胶中消化蛋白质 347

备择方案1在含十二烷基磺酸钠的凝胶中消化蛋白质 349

备择方案2在不含去污剂的凝胶中消化蛋白质 350

11.4 单元溶液中蛋白质的化学切割 350

基本方案1用溴化氰从甲硫氨酸残基的C端切割 351

基本方案2用BNPS-3-甲基吲哚切割色氨酸残基的C端 352

基本方案3用甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肽键 352

基本方案4用羟胺切割天冬酰胺甘氨酸肽键 353

基本方案5用NTCB切割半胱氨酸残基的N端 353

11.5 单元膜上蛋白质的化学切割 354

基本方案1用溴化氰切割甲硫氨酸残基的C端 355

备择方案用溴化氰切割Edman降解法分析过的结合在PVDF膜上的蛋白质 355

基本方案2 BMPS-3-甲基吲哚法切割色氨酸残基的C端 356

基本方案3甲酸切割天冬氨酸脯氨酸肽键 357

基本方案4用羟胺切割天冬酰胺甘氨酸肽键 357

基本方案5用NTCB切割半胱氨酸的N端 357

11.6 单元反相HPLC分离肽 358

基本方案1用反相HPLC分离5～500 pmol的肽 358

基本方案2用反相HPLC分离≤5 pmol的肽 360

辅助方案毛细管HPLC系统的组装 360

11.7 单元N端序列分析 362

仪器使用 362

样品制备 363

第12章 翻译后修饰：糖基化 367

12.1 单元N-糖基化的抑制 367

基本方案N-糖基化的抑制 367

辅助方案丙酮沉淀 371

12.2 单元 N-连接寡糖的内切糖苷酶和糖胺酶的释放 372

基本方案1内切糖苷酶H消化 372

基本方案2肽：N-糖苷酶F消化 373

辅助方案估测糖蛋白中N-连接寡糖链的数目 374

基本方案3唾液酸酶（sialidase或neuraminidase）消化 374

12.3 单元蛋白质上糖磷脂锚的检测 375

基本方案1用Triton X-114对细胞或膜总蛋白质进行提取和分级分离 375

备择方案用Triton X-114对所获蛋白质进行分级分离 376

基本方案2通过完整细胞的PI-PLC消化鉴定GPI锚定的蛋白质 376

第13章 翻译后修饰：磷酸化和磷酸酶 378

13.1 单元用32Pi标记培养细胞及制备用于免疫沉淀的细胞裂解物 379

基本方案用32Pi标记培养细胞及用温和去污剂裂解 379

备择方案在SDS中煮沸裂解细胞 380

13.2 单元磷酸氨基酸的分析 381

基本方案利用酸水解和双向电泳法分析磷酸氨基酸 381

备择方案碱处理以增强点在滤膜上的含磷酸化酪氨酸和磷酸化苏氨酸的蛋白质的检测 383

13.3 单元用免疫学技术检测磷酸化 385

基本方案用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹及用［125I］蛋白A进行检测 385

备择方案用增强化学发光（ECL）检测结合的抗体 386

13.4 单元用酶学技术检测磷酸化 387

基本方案1用非特异性酸性磷酸酶消化磷蛋白 388

备择方案1用非特异性碱性磷酸酶消化磷蛋白 388

基本方案2用蛋白丝氨酸／苏氨酸磷酸酶消化磷蛋白 389

备择方案2用蛋白酪氨酸磷酸酶消化磷蛋白 389

13.5 单元用透化处理的策略研究蛋白质的磷酸化 390

基本方案在透化处理的细胞中分析蛋白质的磷酸化 390

13.6 单元磷酸肽作图及磷酸化位点的鉴定 392

基本方案SDS-PAGE分离的蛋白质经胰蛋白酶水解后进行磷酸肽作图 392

备择方案固定化蛋白质的水解消化 397

辅助方案用于微量序列测定或质谱分析的磷酸肽的制备 398

第14章 翻译后修饰：特定的应用 400

14.1 单元二硫键形成的分析 400

基本方案在完整单层细胞中分析二硫键的形成 401

备择方案在悬浮细胞中分析二硫键的形成 402

14.2 单元蛋白质酰化的分析 402

基本方案1用脂肪酸进行生物合成标记 403

基本方案2脂肪酸连接到蛋白质的分析 404

基本方案3细胞提取物中总蛋白质结合的脂肪酸标记的分析 404

基本方案4脂肪酸标记一致性的分析 406

14.3 单元蛋白质异戊烯化和羧甲基化的分析 406

基本方案1培养细胞中蛋白质的异戊烯化 406

基本方案2培养细胞中蛋白质的羧甲基化 407

14.4 单元蛋白质氧化修饰的分析 408

基本方案1用2，4-二硝基苯肼对蛋白质羰基进行分光光度定量 408

基本方案2用氚标记的硼氢化钠定量蛋白质羰基衍生物 409

基本方案3凝胶电泳分析［14C］碘乙酰胺标记的蛋白质巯基 410

基本方案4用质谱定量蛋白质的二酪氨酸残基 411

辅助方案1 O，O′-二酪氨酸标准品的制备 412

辅助方案2用竞争性ELISA分析蛋白质结合的硝基酪氨酸 413

基本方案5异天冬氨酸形成的酶学分析 414

14.5 单元蛋白质泛素化的分析 415

基本方案1目的蛋白的免疫沉淀及随后的抗Ub免疫印迹 415

基本方案2从表达His6-Ub的细胞中亲和纯化泛素化的蛋白质 416

第15章 蛋白质的化学修饰 419

15.1 单元半胱氨酸的修饰 420

策略设计 420

基本方案1用酰卤试剂（haloacyl reagent）或N-乙基马来酰亚胺对已知大小和组成的蛋白质进行烷基化 421

基本方案2用N-碘乙基三氟乙酰胺进行烷基化 422

基本方案3用丙烯酰胺进行烷基化 423

基本方案4二硫化物的空气氧化 423

辅助方案1比色法定量游离巯基 423

辅助方案2半胱氨酸修饰后的样品脱盐 424

15.2 单元氨基的修饰 425

策略设计 428

基本方案1用琥珀酰亚胺酯进行酰胺化 429

基本方案2异硫氰酸荧光素的加入 429

基本方案3琥珀酰化 430

基本方案4还原性甲基化 430

第16章 质谱 432

16.1 单元肽和蛋白质质谱分析综述 433

在蛋白质结构分析中，为什么质谱是一种必需的工具？ 433

什么是MS？ 434

什么是串联质谱？ 434

MS数据能够定量吗？ 435

样品制备 436

质量测定准确性和质量分辨率的基本原理 437

16.2 单元肽和蛋白质MALDI质量分析用样品的制备 438

基本方案1干滴法 440

基本方案2快速蒸发法 440

辅助方案HCCA的纯化／重结晶 441

16.3 单元用于MALD-MS指纹图蛋白质的凝胶内消化 441

基本方案 441

16.4 单元在网上搜索序列数据库：用MS-Fit鉴定蛋白质 442

基本方案 442

16.5 单元在网上搜索序列数据库：用MS-Tag鉴定蛋白质 444

基本方案 444

16.6 单元使用纳升喷雾连接装置将样品直接导入电喷雾离子化质谱仪中 444

16.7 单元使用微型毛细管液相色谱将样品直接导入电喷雾离子化质谱仪中 446

基本方案1制作集成式LC柱ES针头 446

基本方案2装配ES针头 447

基本方案3微量ES LC/MS连接总成的安装和使用 448

16.8 单元用四极杆离子阱质谱和SEQUEST数据库匹配鉴定蛋白质 449

基本方案 449

16.9 单元通过手工解释MS/MS谱进行从头肽测序 450

基本方案MS/MS谱的手工解释 450

辅助方案1通过甲基酯化证实新测定的序列 454

辅助方案2通过乙酰化证实新测定的序列 454

第17章 肽的制备和处理 456

17.1 单元在塑料针上合成多种肽 456

基本方案肽的多合成针合成 456

辅助方案1制备活化的Fmoc保护的氨基酸溶液 460

辅助方案2肽的N端乙酰化 460

辅助方案3肽的N端生物素化 461

17.2 单元用于生产识别完整蛋白质的抗体的合成肽 461

基本方案1计算机辅助选择适当的抗原肽序列 461

备择方案1手工检查以选择合适的肽序列 462

基本方案2设计用于耦联到载体蛋白质上的合成肽 463

备择方案2设计一种合成的多抗原肽 463

基本方案3使用异型双功能交联剂将合成肽耦联到载体蛋白质上 463

辅助方案1用Ellman试剂分析游离的巯基 464

辅助方案2还原肽中的半胱氨酸基团 466

备择方案3使用同型双功能试剂将合成的肽耦联到载体蛋白质上 466

备择方案4使用碳二亚胺将合成肽耦联到载体蛋白质上 466

辅助方案3肽与载体蛋白质摩尔比率的计算 467

17.3 单元作为蛋白质模拟物的肽树枝状高分子的合成和应用 468

基本方案1 MAP系统的直接Bos合成 469

备择方案直接Fmoc固相合成MAP系统 472

辅助方案1茚三酮试验 474

辅助方案2用透析法纯化MAP系统 474

辅助方案3使用高效凝胶过滤层析纯化MAP 475

基本方案2末端加到侧链上的cMAP的直接合成 475

17.4 单元肽二硫键的形成 477

基本方案1用空气氧化促进二硫键的形成 477

备择方案1通过在树脂上空气氧化促进二硫键的形成 477

备择方案2活性炭／空气介导的分子内二硫化物的形成 478

基本方案2通过铁氰化钾氧化形成分子内二硫化物 478

备择方案3通过铁氰化钾氧化形成分子间或分子内二硫化物 479

备择方案4通过铁氰化钾氧化在树脂上形成二硫化物 479

基本方案3在弱酸性pH条件下用DMSO氧化 479

备择方案5在弱碱性pH条件下用DMSO氧化 480

基本方案4用氧化还原缓冲液氧化 480

基本方案5由固相Ellman试剂介导的氧化 480

基本方案6用碘同时去保护／氧化 482

备择方案6用碘在树脂上同时进行S-ACM去保护／氧化 482

基本方案7用Tl（Ⅲ）同时进行S-ACM去保护／氧化 483

备择方案7用Tl（Ⅲ）在树脂上同时进行S-ACM去保护／氧化 483

基本方案8烷基三氯硅烷亚砜氧化 484

第18章 蛋白质互相作用的鉴定 485

18.1 单元蛋白质蛋白质相互作用的分析 485

基本概念 485

平衡参数 486

动力学参数 487

18.2 单元用相互作用阱／双杂交系统鉴定相互作用的蛋白质 489

18.3 单元用基于噬菌体的表达克隆鉴定相互作用的蛋白质 497

策略设计 497

18.4 单元用共沉淀法检测蛋白质蛋白质相互作用 498

基本方案与蛋白A-Sepharose或蛋白G-Sepharose共沉淀的蛋白质 499

备择方案GST融合蛋白的共沉淀 499

18.5 单元用酵母双杂交芯片高通量筛选蛋白质-蛋白质相互作用 500

基本方案1蛋白质组规模的酵母蛋白质芯片的制备 500

基本方案2用酵母蛋白质芯片对蛋白质相互作用进行手工筛选 502

18.6 单元用far Western分析鉴定蛋白质的相互作用 503

基本方案蛋白质混合物的farWestern分析 504

备择方案1用免疫印迹检测相互作用的蛋白质 505

备择方案2在far Western印迹中用肽鉴定特异性的相互作用序列 505

18.7 单元用于研究生物分子相互作用的闪烁邻近分析法（SPA） 506

第19章 蛋白质相互作用的定量 509

19.1 单元蛋白质相互作用定量的概述 509

表面等离子共振 510

分析型超速离心（沉降平衡和沉降速度） 513

19.2 单元滴定量热法（titration calorimetry） 513

基本方案1用恒温滴定微量量热法确定摩尔比率、观察的亲和力（Kobs d）和观察的结合焓的变化（△Hobs） 514

基本方案2用ITC确定生物化学结合热力学：△Go′、△Ho′和△Co′p 518

19.3 单元用于测量蛋白质缔合平衡的缩比大区带分析型凝胶过滤层析 519

基本方案缩比大区带分析型凝胶过滤层析 519

辅助方案1数据分析 521

辅助方案2蛋白质装配过程的动量学和化学计量的确定 522

单体二聚体平衡缔合测量数据的调整 523

19.4 单元带在线式光散射的分子排阻层析 523

基本方案1使用折射率和光散射计算不含碳水化合物蛋白质的分子质量和自缔合程度（双检测器法） 523

备择方案1合用光散射检测器和紫外检测器来计算非糖基化蛋白质的分子质量（双检测器法） 524

备择方案2用于大蛋白质的分子排阻层析和光散射：DEBYE分析 525

备择方案3绝对分子质量校准法 525

基本方案2使用光散射和反射率计算不含碳水化合物的蛋白质蛋白质复合物的化学计量 525

备择方案4使用光散射和紫外计算糖蛋白的蛋白质蛋白质相互作用的化学计量 526

第20章 肽酶 527

20.1 单元蛋白酶 527

蛋白酶的生物学重要性 527

蛋白酶的命名法 528

可有效地细分许多蛋白酶的3种方式 528

20.2 单元酿酒酵母蛋白酶体的纯化和定性 537

基本方案1用阴离子交换层析和凝胶过滤纯化酵母26S蛋白酶体 537

备择方案用亲和层析纯化酵母26S蛋白酶体 538

基本方案2用常规层析纯化酵母20S蛋白酶体 539

辅助方案1 26S和20S蛋白酶体肽酶活性的分析 540

辅助方案2多聚泛素化溶菌酶的制备 540

辅助方案3放射性标记酪蛋白的制备 543

辅助方案4用26S蛋白酶体降解蛋白质底物 543

辅助方案5蛋白酶体的非变性凝胶电泳／胶内肽酶分析 543

20.3 单元真核生物20S蛋白酶体的纯化 544

基本方案从牛脑垂体纯化20S蛋白酶体 544

辅助方案分析蛋白酶体催化的切割的酶分析法 547

20.4 单元丝氨酸蛋白酶抑制剂 548

基本方案1用柱层析纯化人抗凝血酶 548

辅助方案洗脱组分中抗凝血酶的分析 550

基本方案2在无糖胺聚糖存在的情况下分析抗凝血酶抑制——“递增的抗凝血酶活性” 550

基本方案3在糖胺聚糖存在的情况下分析抗凝血酶抑制——“肝素辅因子活性” 551

20.5 单元用GFP作为报道蛋白分析序列特异性蛋白酶 552

基本方案位点特异性蛋白酶的荧光分析 552

辅助方案用金属螯合层析纯化底物-GFP融合蛋白 553

备择方案位点特异性蛋白酶的荧光共振能量转移分析 554

20.6 单元活性丝氨酸蛋白酶及其变异体的过表达和从大肠杆菌包含体中的纯化 555

基本方案1微小纤溶酶原及其变异体的过表达和从大肠杆菌包含体中的纯化 555

基本方案2微小纤溶酶原的激活及具有催化活性微小纤溶酶的纯化 557

辅助方案1确定重组微小纤溶酶活性的分析方法 557

辅助方案2确定活性位点浓度的分析方法 558

20.7 单元在细胞环境中分析蛋白酶 559

基本方案1用细胞渗透性肽底物原位监测细胞内蛋白酶的活性 559

基本方案2通过自溶激活和内源底物蛋白质降解原位监测细胞内蛋白酶活性 560

基本方案3监测细胞裂解物反映出的蛋白酶活性水平 561

基本方案4原位监测分泌的蛋白酶活性 562

基本方案5用酶谱法测量细胞分泌的MMP活性 563

20.8 单元caspase的表达、纯化和定性 564

基本方案1 caspase在大肠杆菌中的表达 564

基本方案2 caspase酶分析 567

辅助方案1重组caspase的滴定 568

辅助方案2 caspase底物的制备 568

第21章 基于凝胶的蛋白质组分析 570

21.1 单元使用双向差异凝胶电泳（2-D DIGE）确定蛋白质谱 570

基本方案用花青染料（CyDye DIGE荧光素）标记蛋白质用于双向电泳 570

辅助方案用于Cy标记反应的蛋白质的制备 573

备择方案用质谱技术鉴定DIGE胶中的蛋白质 574

21.2 单元用于蛋白质组分析的激光捕获显微分离技术 575

基本方案1激光捕获显微分离技术（LCM） 575

备择方案LCM组织切片的免疫标记 576

辅助方案1 LCM分析用组织的收集和保存 577

辅助方案2使用SYPRO RUBY染料对LCM捕获材料中的蛋白质进行定量 578

基本方案2使用免疫印迹分析LCM捕获的材料 578

基本方案3 SELDI质谱 579

附录1 试剂和溶液 582

附录2 常用的度量制和数据 651

附录3 常用技术 673

附录3A 蛋白质折叠剂的使用 673

附录3B 透析 676

附录3C 玻璃器具硅烷化 678

附录3D 使用硫酸铵的蛋白质沉淀 679

附录3E 琼脂糖凝胶电泳 685

附录3F 用吸收光谱法进行核酸定量 686

附录4 试剂和设备供货商 689

参考文献 734

索引 748