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第1章 抗体 1

1.1 一种多功能分子——抗体 1

1.2 相关伦理思考 3

1.3 实验室安全 4

1.4 手册编排 4

参考文献 4

第2章 抗原 5

2.1 抗原的选择 5

2.2 多肽抗原 6

2.2.1 多肽抗原的免疫进度表 7

2.3 蛋白质抗原 7

2.3.1 原核蛋白 8

2.3.2 真核蛋白 11

2.4 全细胞免疫原 12

2.4.1 全细胞免疫原的免疫方案 13

2.5 基因免疫 14

2.5.1 质粒DNA 14

2.5.2 腺病毒 16

参考文献 17

第3章 佐剂 20

3.1 引言 20

3.2 佐剂的使用 22

3.2.1 总体要求 22

3.2.2 弗氏佐剂的使用 23

3.2.3 TiterMax佐剂的使用方案 25

3.2.4 Ribi佐剂系统（RAS）的应用 26

3.2.5 Gerbu佐剂的应用 27

3.2.6 Imject铝盐佐剂的使用 27

参考文献 28

第4章 多克隆抗体制备 30

4.1 概要 30

4.2 抗原提呈细胞 30

4.2.1 B细胞的抗原识别 32

4.2.2 T细胞的抗原识别 32

4.2.3 B细胞受体和抗体产生 34

4.2.4 免疫记忆 34

4.2.5 抗体 34

4.2.6 佐剂的作用 35

4.2.7 抗原特点 39

4.2.8 免疫途径 40

4.2.9 免疫步骤 44

4.2.10 物种选择 44

4.3 结论 48

参考文献 48

第5章 单克隆抗体的制备 55

5.1 引言 55

5.2 材料 56

5.2.1 免疫原 56

5.2.2 免疫用的动物 57

5.2.3 免疫策略 58

5.3 免疫程序 60

5.3.1 培养基和骨髓瘤细胞 60

5.3.2 免疫B细胞的制备 63

5.3.3 融合和铺板 63

5.3.4 筛选 65

5.3.5 亚克隆和低温冻存 66

5.3.6 杂交瘤细胞的扩增 68

5.4 结论 69

参考文献 70

第6章 单克隆抗体的定量生产 72

6.1 引言：方法比较 72

6.2 抗体制备方法概况 72

6.2.1 产量 73

6.2.2 费用和设备 73

6.2.3 动物福利 73

6.2.4 免疫活性分子污染 74

6.2.5 微生物污染 74

6.2.6 抗体糖基化 75

6.3 腹水的制备 75

6.3.1 方法概述 75

6.3.2 免疫原同种异体反应性或异种抗原反应性的对策 76

6.3.3 体内制备方案：BALB/c小鼠腹水 77

6.3.4 体内单克隆抗体的制备：通过异种的杂交瘤细胞系制备腹水 80

6.4 细胞培养制备单克隆抗体 83

6.4.1 在研究实验室中体外制备单克隆抗体 83

6.4.2 实验方案：在CELLine CL-1000培养瓶中制备单克隆抗体 85

6.4.3 用重组和转基因系统制备抗体 89

6.5 结论 89

参考文献 89

第7章 抗体的纯化和鉴定 94

7.1 引言 94

7.2 抗体纯化 94

7.2.1 通过沉淀进行部分纯化 95

7.2.2 蛋白质A和蛋白质G 97

7.2.3 IgM和FAB抗体片段的纯化 103

7.3 抗体的鉴定 107

7.3.1 区带（醋酸纤维）电泳 107

7.3.2 通过280nm吸光度测定抗体浓度 108

7.3.3 SDS-PAGE 109

7.3.4 免疫印迹 111

7.3.5 等电聚焦 113

7.3.6 酶免疫分析 114

7.4 结语 116

参考文献 116

第8章 细菌中制备抗体 117

8.1 引言 117

8.2 所需材料 119

8.3 方法 121

8.3.1 噬粒设计 121

8.3.2 文库构建 122

8.3.3 抗原特异性抗体的筛选 128

参考文献 132

第9章 抗体的化学和蛋白水解修饰 136

9.1 引言 136

9.2 一般步骤 137

9.2.1 抗体溶液的稳定性 137

9.2.2 抗体的定量 138

9.2.3 抗体的浓缩和缓冲液置换 140

9.3 胺类的修饰 142

9.3.1 总体考虑 142

9.3.2 胺反应试剂的分类 144

9.3.3 NHS-PEO4-BIOTIN的生物素化反应 146

9.3.4 用荧光染料进行标记 151

9.3.5 巯基的导入 152

9.3.6 聚乙二醇化 154

9.3.7 与螯合剂的偶合 154

9.4 巯基和二硫键的修饰 156

9.4.1 IgG的二硫键和巯基 156

9.4.2 二硫化物的互换反应 157

9.4.3 其他涉及巯基和二硫键的氧化-还原试剂 161

9.4.4 用卤代烃和N-烷基马来酰亚胺进行硫醇的烷基化 162

9.5 碳水化合物修饰 163

9.5.1 范例流程10：用NaIO4氧化IgG的碳水化合物部分 164

9.5.2 范例流程11：DAVLB酰肼与氧化型IgG的偶合 165

9.6 抗体的固相化 165

9.6.1 聚苯乙烯培养皿和ELISA孔的固相化 165

9.6.2 与亲和介质的共价偶合 166

9.6.3 经生物素介导与亲和介质的固相化 168

9.7 蛋白的水解修饰 170

9.7.1 木瓜蛋白酶水解兔IgG制备Fab片段 172

9.8 抗体与其他蛋白质的交联 177

9.8.1 范例流程18：肼与IgG氨基的交联 178

9.8.2 范例流程19：醛与另一个蛋白质氨基的交联 180

9.8.3 范例流程20：MEHN-IgG与FB-蛋白质的交联 181

参考文献 182

第10章 抗体的应用 184

10.1 引言 184

10.2 蛋白质转印 185

10.2.1 转印设备 185

10.2.2 转印缓冲液 187

10.2.3 条件的优化 187

10.2.4 转印膜 187

10.3 检测 189

10.3.1 蛋白质印迹的直接染色 189

10.3.2 抗原的检测 189

10.3.3 蛋白质免疫印迹的检测抗体 190

10.3.4 免疫印迹实验中抗体的替代品 191

10.3.5 蛋白质免疫印迹的定量 192

10.3.6 相对分子质量标准品 193

10.4 蛋白质免疫印迹实验的操作程序 194

10.4.1 操作流程 195

10.4.2 免疫印迹实验需要的溶液 196

10.5 实验假象以及故障的诊断和排除 198

10.6 抗体芯片 198

10.7 临床应用 199

10.8 免疫沉淀反应及其相关应用 200

10.9 总结 201

参考文献 202

第11章 免疫组织化学法 206

11.1 引言 206

11.1.1 方法学概述 206

11.1.2 对新的免疫组织化学方法进行标准化的一种实用方法 206

11.1.3 免疫组织化学中的抗体 207

11.2 组织准备 208

11.2.1 载玻片 209

11.2.2 细胞涂片／离心细胞涂片制备 209

11.2.3 冰冻切片 210

11.2.4 石蜡切片 210

11.2.5 细胞块 211

11.3 酶标记 211

11.3.1 辣根过氧化物酶 212

11.3.2 碱性磷酸酶 212

11.4 背景与非特异反应产生的原因 212

11.4.1 内源性酶活性 212

11.4.2 其他内源性物质活性 213

11.4.3 一抗产生的非特异结合反应或背景染色的原因 213

11.4.4 疏水作用和离子相互作用产生的背景 214

11.5 抗原修复技术（AR） 215

11.5.1 去污剂和离液序列高的物质 215

11.5.2 酶抗原修复法 216

11.5.3 热诱导抗原决定簇修复（HIER） 216

11.6 免疫酶技术 218

11.6.1 直接法 219

11.6.2 间接法 220

11.6.3 多步法 221

11.7 免疫荧光技术 227

11.7.1 荧光染料 227

11.7.2 间接免疫荧光技术 228

附录 228

A.1 免疫组织化学染色试剂 228

A.1.1 内源性过氧化物酶封闭液 228

A.1.2 内源性碱性磷酸酶封闭液 229

A.1.3 非特异结合性封闭液 230

A.1.4 内源性亲和素／生物素封闭液 230

A.1.5 抗原修复缓冲液 231

A.1.6 胰蛋白酶抗原修复溶液 231

A.1.7 抗原修复中的蛋白酶 232

A.1.8 抗原修复中的胃蛋白酶 232

A.1.9 漂洗缓冲液TBS 500mmol/L，pH7.6 232

A.1.10 磷酸盐缓冲液（PBS），20mmol/L，pH7.0 233

A.1.11 抗体稀释缓冲液 233

A.1.12 底物及色原的制备 234

参考文献 238

第12章 免疫电子显微镜 239

12.1 引言 239

12.2 抗体 240

12.2.1 一抗 240

12.2.2 常见问题解析 240

12.2.3 二抗 241

12.2.4 试剂滴定 241

12.2.5 非特异性背景染色 242

12.2.6 对照 243

12.3 标记物 243

12.3.1 胶体金 243

12.3.2 其他电子密度标记物 245

12.3.3 重金属标记物显色的故障诊断与排除 245

12.3.4 多重标记应用 245

12.3.5 标记定量 246

12.4 组织标记 246

12.4.1 固定 246

12.4.2 包埋前标记 246

12.4.3 颗粒样本 247

12.4.4 复型标记 248

12.4.5 冷冻切片标记 248

12.4.6 非冷冻组织包埋后标记 250

12.4.7 冷冻置换 251

12.5 与其他免疫显微镜的相关性 251

参考文献 252

第13章 流式细胞术 256

13.1 引言 256

13.1.1 现有技术 256

13.1.2 抗体选择 257

13.1.3 实验初始应考虑的因素 257

13.1.4 对照 258

13.1.5 特异性 258

13.1.6 仪器显示和质量控制 259

13.2 免疫分型 260

13.2.1 抗体滴度测定 260

13.2.2 直接标记法 264

13.2.3 间接标记法 266

13.2.4 胞内标记法 268

参考文献 271

第14章 酶联免疫吸附试验 272

14.1 引言 272

14.2 准备 272

14.2.1 抗体 272

14.2.2 检测反应 274

14.3 安全性 275

14.3.1 “夹心”ELISA 275

14.3.2 “竞争”ELISA 276

参考文献 278

第15章 抗体的未来：挑战与机遇 280

15.1 引言 280

15.2 抗体的新来源 280

15.2.1 从转基因动物制备人类抗体 280

15.2.2 基因免疫制备抗体 280

15.2.3 avimer：替代抗体 281

15.3 使用抗体的新方法 281

15.3.1 抗体片段和单功能区抗体 281

15.3.2 抗体和蛋白组学 282

15.3.3 杂合和嵌合抗体的表达载体 282

15.3.4 DNA疫苗 282

15.3.5 抗体的其他应用 282

15.4 未来 283

参考文献 283

索引 285