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第一章 生物医学试验方法策略 1

第一节 研究问题的提出和研究方法的确立 1

一、研究领域的发展 1

二、问题的提出 3

三、提出问题的假说或理论 4

四、研究方向的界限 5

五、研究内容的界定 6

第二节 实验方法学的对应 7

一、实验对象的选择 7

二、实验对照的考虑 8

三、技术方法的选用 9

四、技术路线的确立 10

五、实验内容与处理因素的相应性 11

第三节 实验内容的合理与完善 12

一、时间和空间的相关性 12

二、实验的可重复性 12

三、体外实验与体内实验的一致性 12

四、生命组学的应用 13

五、实验结果的连贯性 13

六、实验的补充（或替补与完善） 13

第四节 实验结果的分析与讨论 13

一、确立实验结果内涵的不同性或差异 13

二、不同性或差异性对于生物医学研究的局限 14

三、与前人（或他人）研究的连续或发展 14

四、回答所提出的问题的真实性 14

五、对假说（或理论）成立的解答或判定 14

第五节 试验资料的整理与论文发表 15

一、明确影响因子在相应刊物的格式要求 15

二、按相应刊物格式要求进行文章写作 15

三、参考文献的阅读和引用，强调最新文献的引用 15

四、依据实验结果讨论所提出的问题，回答其真实性 17

五、依托和结合文献提供的领域发展，解答或判定假说（或理论）的成立 17

第二章 实验室规则及安全防护 18

第一节 实验室规则 18

第二节 实验室安全防护 18

一、实验室安全制度 18

二、生物安全管理 19

三、实验动物的安全管理 20

四、化学药品的安全管理 21

五、实验室“三废”处理 22

第三章 基因组学常用实验技术 23

第一节 核酸分离纯化 23

一、基因组DNA的提取制备 23

二、总RNA的提取制备 25

三、质粒DNA的提取制备 27

四、琼脂糖凝胶电泳 29

五、聚合酶链式反应技术 31

六、反转录PCR 38

七、荧光定量PCR技术 40

八、限制性内切酶 46

九、凝胶中DNA片段的纯化回收 51

第二节 分子杂交技术 52

一、核酸分子探针的种类 53

二、探针的标记物 54

三、探针的标记方法 55

四、标记探针的检测方法 63

五、固相核酸杂交方法 68

第三节 DNA序列分析技术 80

一、DNA测序原理 80

二、DNA测序的常用技术 81

三、DNA测序策略 81

四、全自动激光荧光DNA测序 83

第四节 DNA芯片的使用 86

一、DNA芯片的概述 86

二、DNA芯片的应用 86

三、DNA芯片的制作 88

四、实验步骤 89

五、注意事项 90

第五节 细菌培养技术 91

一、原理 91

二、仪器、材料与试剂 91

三、实验步骤 92

四、注意事项 92

第六节 感受态细胞制备 92

一、原理 92

二、实验材料准备 93

三、实验步骤 93

四、注意事项 94

第七节 DNA体外重组技术 94

一、原理 94

二、DNA体外重组载体的种类和选择 95

三、基因工程中常用的工具酶 97

四、实验方法 100

第八节 外源基因在原核生物中的表达 103

一、实验原理 103

二、实验步骤 104

三、注意事项 105

第九节 外源基因在真核细胞中的表达 105

一、磷酸钙共沉淀 106

二、电穿孔法 106

三、阳离子脂质体试剂 108

第十节 反义RNA 109

一、反义RNA的原理 109

二、反义RNA的应用 110

三、反义RNA的实验步骤 110

四、注意事项 111

第十一节 RNA干扰 111

一、RNA干扰的原理 111

二、RNA干扰的应用 113

三、RNA干扰的实验步骤 113

四、注意事项 115

第十二节 基因敲除 115

一、基因敲除的原理 115

二、动物基因敲除的步骤 116

三、动物基因敲除的应用 117

第十三节 转基因动物 118

一、转基因动物的原理 118

二、转基因动物的步骤 119

三、转基因动物的主要方法 119

四、转基因动物的应用 120

附：肺结核杆菌rpoB基因DNA的扩增及测序分析实例 122

第四章 蛋白质分离鉴定相关技术 129

第一节 根据分子量大小不同进行分离纯化蛋白质 129

一、凝胶过滤层析 129

二、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 131

第二节 根据蛋白质带点性不同进行分离纯化 134

一、离子交换层析法的原理 134

二、离子交换剂及平衡缓冲剂的选择原则 134

三、离子交换柱的装柱与平衡方法 135

四、待纯化样品的准备和加样方法 135

五、洗脱分离过程 135

六、目标蛋白峰与杂峰的分离策略 135

七、离子交换剂的处理和保存 135

八、离子交换层析操作注意事项 136

第三节 根据蛋白质的疏水性不同进行分离纯化 136

一、疏水作用层析的基本原理 136

二、层析介质的选择 137

三、对样品的要求 137

四、常用的洗脱方式 137

五、层析介质的清洗与再生注意事项 137

六、影响疏水性吸附的主要因素 138

第四节 根据蛋白质的极性差异进行分离纯化 138

一、反相层析的基本原理 138

二、反相层析的应用特点 139

三、反相层析的操作要点 139

四、反相层析应用的注意事项 140

第五节 根据蛋白质的配体特异性进行分离纯化 140

一、亲和层析的基本原理 140

二、亲和层析的基质与配基的选择 141

三、亲和层析的基本实验步骤 141

四、亲和层析的操作注意事项 142

第六节 根据蛋白质的等电点差异进行分离纯化 142

一、等电聚焦电泳的实验原理 142

二、等电聚焦电泳所用的仪器和试剂 143

三、等电聚焦电泳实验全流程简介 143

第七节 用高效液相色谱方法进行蛋白质的分离纯化 145

一、高效液相色谱法的基本原理 145

二、高效液相色谱仪的组成 146

三、HPLC在蛋白质分离中的应用及操作规程 146

四、注意事项 148

第八节 蛋白质的浓缩方法 149

一、离子交换吸附法 150

二、沉淀法 150

三、超滤法 152

四、冷冻干燥法 153

五、吸收法 154

第九节 蛋白质浓度定量方法 154

一、Lowry法 154

二、紫外吸收法测定蛋白质含量 156

三、考马斯亮蓝G-250染色法 157

四、BCA法 158

第十节 蛋白质分子量测定方法 159

一、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 159

二、凝胶过滤层析法 162

第十一节 混合蛋白中特定蛋白质的含量的测定方法 165

一、酶联免疫吸附技术 165

二、蛋白质印迹 167

第十三节 用于蛋白质定性和定量的质谱方法 169

一、电喷雾离子化质谱（ESI-MS） 169

二、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 171

三、高效液相色谱／双向电泳与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱联用 172

附：蛋白质定性、定量分析应用实例 174

第五章 代谢组学 179

一、代谢组学简介 179

二、代谢组学的研究方法 181

三、代谢组学在医学领域的应用 193

附：代谢组学应用实例 196

第六章 细胞学相关实验技术 208

第一节 细胞培养基本知识 208

一、体外培养细胞的种类 208

二、体外培养细胞的特征 209

三、培养细胞所需的条件与环境 210

四、细胞培养室的设置 212

五、细胞培养室的设备 214

六、细胞培养用品的清洗和消毒灭菌 216

第二节 细胞培养的基本技术 221

一、基本操作技术和要求 221

二、原代培养 224

三、传代培养和细胞系的维持 225

四、细胞冻存与复苏 227

第三节 细胞形态观察与检测 229

一、活细胞观察法 229

二、细胞固定染色法 233

三、电子显微镜观察法 235

第四节 细胞遗传学的检测方法 249

一、染色体结构显示与检测 249

二、染色体基因定位 251

第五节 细胞生物行为研究方法 253

一、细胞活力检测方法 253

二、细胞生长曲线 257

三、细胞凋亡的检测方法 258

四、克隆（集落）形成试验 265

五、细胞迁移运动与侵袭能力实验 266

六、细胞黏附实验 268

七、膜片钳术 269

第六节 细胞及细胞器分离技术 271

一、采用离心技术分离淋巴细胞 272

二、流式细胞分选技术 272

三、有限稀释法 273

四、平皿克隆分离法 274

五、软琼脂克隆分离法 274

六、单细胞显微克隆 275

七、细胞器分离技术 276

八、应用实例——肿瘤细胞中SP细胞流式分选 281

第七节 细胞内化学成分的测定 283

一、细胞内钙离子浓度测定 283

二、细胞内药物浓度测定 285

附：细胞模型应用实例 287

第七章 免疫学实验技术 292

第一节 概论 292

一、抗原抗体反应的原理 292

二、抗原抗体反应的特点 292

三、抗原抗体反应的类型 293

第二节 沉淀反应 293

一、环状沉淀反应 294

二、单向琼脂扩散 294

三、双向琼脂扩散 296

四、火箭电泳 297

五、对流免疫电泳 298

六、免疫电泳 299

第三节 凝集反应 300

一、直接凝集反应 300

二、间接凝集反应 301

第四节 补体参与反应 304

一、补体结合实验 304

二、血清总补体活性测定（CH50单位测定） 309

三、用于检测未知抗体的间接法 310

四、化学发光免疫分析技术 312

五、免疫胶体金标记技术 314

六、生物素—亲和素技术 316

第五节 免疫细胞的分离与纯化 318

一、白细胞的分离与纯化 318

二、外周血的单个核细胞分离 319

三、外周血单核细胞分离 322

四、淋巴细胞的纯化与亚群分离 323

五、流式细胞术的免疫分析（详见第六章 ） 330

六、应用实例——吸附分离法（贴壁法）分离外周血单核细胞 332

第六节 淋巴细胞的功能检测 333

一、T淋巴细胞功能检测 333

二、B淋巴细胞功能检测 337

第七节 NK细胞活性检测 342

一、乳酸脱氢酶释放法 342

二、应用实例——YAC-1细胞株作为靶细胞测定人NK细胞活性 343

第八节 吞噬细胞功能检测 344

一、中性粒细胞吞噬功能测定 345

二、人巨噬细胞吞噬功能检测 346

三、小鼠巨噬细胞吞噬功能测定 347

第九节 抗体的制备技术 348

多克隆抗体的制备及鉴定 348

附：直接免疫荧光法测抗原实例 353

第八章 系统生物学简介 356

一、系统生物学定义 356

二、系统生物学的研究原理及内容 357

三、系统生物学的研究方法 358

四、系统生物学在医学领域研究思路举例 368