蛋白质电泳实验技术 第2版PDF电子书下载

第1章 电泳概论 1

1.1 电泳的早期历史 1

1.2 电泳的简单原理及分类 5

1.3 凝胶电泳技术的历史 7

参考文献 8

第2章 凝胶电泳的支持介质 11

2.1 聚丙烯酰胺凝胶的形成和结构 11

2.2 丙烯酰胺和N,N′-甲叉双丙烯酰胺的纯化和毒性 14

2.3 引发剂、增速剂和聚合 15

2.4 聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径和分子筛效应 17

2.5 琼脂糖凝胶的性能、结构与特点 18

2.6 电泳新介质 23

参考文献 25

第3章 凝胶电泳仪器的进展 27

3.1 电泳槽 27

3.1.1 圆盘电泳 28

3.1.2 垂直电泳 29

3.1.3 水平电泳 31

3.1.4 垂直与水平平板电泳的比较 33

3.2 各种灌胶模具 34

3.3 电源 35

3.4 外循环恒温系统 35

3.5 自动凝胶染色仪 36

3.6 凝胶干燥仪 36

3.7 电泳转移仪 36

3.8 电泳洗脱仪 37

3.9 制备电泳仪 37

3.10 凝胶扫描和摄录装置 38

3.11 从双向电泳凝胶中自动切取蛋白斑点的仪器 39

参考文献 41

第4章 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 42

4.1 原理 42

4.1.1 蛋白质的电泳行为 42

4.1.2 原理 43

4.1.3 缓冲系统的选择 44

4.1.3.1 pH的选择 44

4.1.3.2 离子强度的选择 46

4.1.4 凝胶浓度的选择 47

4.1.4.1 浓缩胶与分离胶 48

4.1.4.2 浓缩胶的作用原理 48

4.1.4.3 均一胶和梯度胶 49

4.1.5 连续电泳和不连续电泳 49

4.1.6 分子质量测定 51

4.2 方法 53

4.2.1 制胶 53

4.2.1.1 垂直平板电泳的制胶 53

4.2.1.2 水平平板电泳的制胶 56

4.2.2 样品的准备 60

4.2.2.1 选择合适的样品缓冲液 60

4.2.2.2 蛋白标准的准备 60

4.2.2.3 样品浓度 60

4.2.2.4 加样要求 61

4.2.3 电泳 61

4.2.3.1 垂直电泳 61

4.2.3.2 水平电泳 61

4.2.4 检测 62

4.2.4.1 早期染色方法 62

4.2.4.2 考马斯亮蓝染色 63

4.2.4.3 银染色 66

4.2.4.4 其他染色方法 69

4.2.4.5 一些蛋白的染色方法 70

4.2.4.6 同工酶染色 72

4.2.4.7 荧光探针法 75

4.2.4.8 免疫方法 76

4.2.4.9 电泳转移 77

4.2.4.10 电泳后蛋白带的氨基酸分析 77

4.2.5 照相、凝胶干燥 78

4.2.6 定量测定 78

4.3 实验考虑 79

4.3.1 电泳方法和方式的选择 79

4.3.2 最佳凝胶浓度和缓冲系统的选择 79

4.3.3 凝胶聚合不佳的原因和对策 80

4.3.4 样品的预处理 81

4.3.5 阳极电泳和阴极电泳 81

4.3.6 半干技术 81

4.3.7 检测方法的选择 83

4.3.8 电泳过程中的不正常现象和对策 83

4.3.9 电泳结果的分析 84

参考文献 86

第5章 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 92

5.1 原理 92

5.1.1 蛋白质分子的解聚 92

5.1.2 缓冲系统的选择 94

5.1.3 凝胶浓度的选择 95

5.1.4 分子质量测定 96

5.1.4.1 分子质量测定的理论背景 96

5.1.4.2 蛋白标准 96

5.1.4.3 分子质量的计算 99

5.1.5 低分子质量多肽的SDS电泳 99

5.2 方法 100

5.2.1 制胶（用于垂直电泳或水平电泳） 100

5.2.2 样品的准备 103

5.2.2.1 样品缓冲液的配制 103

5.2.2.2 蛋白标准的准备 104

5.2.2.3 样品浓度和加样要求 104

5.2.3 电泳 104

5.2.3.1 垂直电泳 104

5.2.3.2 水平电泳 105

5.2.4 检测 106

5.2.4.1 考马斯亮蓝染色 106

5.2.4.2 银染色 107

5.2.4.3 其他染色方法 108

5.2.4.4 荧光探针法 109

5.2.4.5 电泳转移 109

5.2.4.6 电泳后蛋白带的氨基酸组成和序列分析 109

5.2.4.7 电泳后的肽图分析 110

5.2.5 照相、凝胶干燥 110

5.2.6 定量测定 110

5.3 实验考虑 110

5.3.1 SDS电泳是测定蛋白质亚基分子质量的最佳选择 110

5.3.2 凝胶浓度和缓冲系统的选择 111

5.3.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶聚合不佳的原因对策 112

5.3.4 SDS-琼脂糖凝胶电泳 112

5.3.5 去污剂的选择 112

5.3.5.1 阳离子和阴离子去污剂 112

5.3.5.2 非离子去污剂 113

5.3.5.3 酸-尿素去污剂 113

5.3.5.4 电荷位移电泳 114

5.3.6 样品的处理 114

5.3.6.1 还原SDS处理 114

5.3.6.2 带有烷基化作用（alkylation）的还原SDS处理 115

5.3.6.3 非还原的SDS处理 115

5.3.7 半干技术 116

5.3.8 检测方法的选择 116

5.3.9 生物活性的恢复 117

5.3.9.1 在凝胶中恢复活性 117

5.3.9.2 电泳转移后恢复生物活性 118

5.3.9.3 洗脱后在自由溶液中恢复生物活性 118

5.3.10 电泳过程中的不正常现象和对策 118

5.3.11 电泳结果的分析 118

参考文献 118

第6章 载体两性电解质pH梯度等电聚焦 122

6.1 原理 122

6.1.1 蛋白质的等电点 122

6.1.2 等电聚焦——在pH梯度中的电泳 123

6.1.3 等电聚焦的分辨率 124

6.2 载体两性电解质和pH梯度的形成 125

6.2.1 历史 125

6.2.2 合成 126

6.2.2.1 Ampholine的合成（原瑞典LKB公司） 126

6.2.2.2 Pharmalyte的合成（原瑞典Pharmacia公司） 127

6.2.2.3 Servalyte的合成（德国Serva公司） 128

6.2.2.4 实验室合成 128

6.2.3 特性 128

6.2.3.1 分子质量小 128

6.2.3.2 可溶性好 129

6.2.3.3 缓冲能力强 129

6.2.3.4 导电性均匀 129

6.2.3.5 紫外吸收低，不发荧光 130

6.2.3.6 容易从聚焦的蛋白带中除去 130

6.2.3.7 无毒、无生物学效应 130

6.2.3.8 螯合性质 130

6.2.4 pH梯度的形成 130

6.3 薄层分析等电聚焦的方法 132

6.3.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 132

6.3.1.1 制胶 132

6.3.1.2 等电聚焦 134

6.3.1.3 pH梯度测定 135

6.3.1.4 固定、染色、脱色 135

6.3.1.5 保存 136

6.3.2 琼脂糖凝胶等电聚焦 136

6.3.2.1 制胶 136

6.3.2.2 等电聚焦 137

6.3.2.3 pH梯度的测定 138

6.3.2.4 固定、染色、脱色、保存 138

6.4 实验考虑 139

6.4.1 稳定介质的选择 139

6.4.2 稳定介质的电内渗 139

6.4.3 载体两性电解质和pH梯度范围的选择 141

6.4.4 丙烯酰胺的聚合 142

6.4.5 电极溶液 143

6.4.6 四甲基乙二胺（TEMED）对丙烯酰胺凝胶的聚合和pH梯度的影响（扩展pH梯度碱性侧） 144

6.4.7 样品的预处理 145

6.4.8 加样方法 147

6.4.9 电参数（电压、电流、功率、温度和时间） 148

6.4.10 pH梯度和pI的测定 151

6.4.11 聚焦后的检测 152

6.4.11.1 各种染色方法 152

6.4.11.2 扫描与定量 153

6.4.11.3 电泳转移 153

6.4.11.4 双向电泳 154

6.4.11.5 滴定曲线 154

6.4.12 聚焦过程中出现的问题及解决办法 154

6.4.12.1 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 154

6.4.12.2 琼脂糖凝胶等电聚焦 157

参考文献 158

第7章 固相pH梯度等电聚焦 162

7.1 原理 162

7.1.1 固相pH梯度介质的结构和合成 162

7.1.2 Immobiline的物化特性 165

7.1.3 固相pH梯度的原理 168

7.1.3.1 Henderson-Hasselbalch公式 168

7.1.3.2 一个pH范围的固相pH梯度 168

7.1.3.3 窄范围和宽范围的pH梯度 171

7.1.3.4 固相pH梯度的计算机模拟 173

7.1.4 分辨率 173

7.2 方法 177

7.2.1 制胶 177

7.2.1.1 选择pH范围，计算缓冲与滴定Immobiline的体积 177

7.2.1.2 贮液配置 177

7.2.1.3 模具组装和凝胶溶液的配制 177

7.2.1.4 灌胶 178

7.2.1.5 洗胶和吹胶 178

7.2.2 等电聚焦 179

7.2.3 pH梯度的测定 180

7.2.4 检测 180

7.2.4.1 各种染色方法 180

7.2.4.2 凝胶干燥与保存 180

7.2.4.3 扫描与定量 180

7.2.4.4 双向电泳 180

7.2.4.5 电泳转换 180

7.3 实验考虑 181

7.3.1 固相pH梯度的优缺点 181

7.3.2 pH范围的选择 182

7.3.3 灌胶与聚合 182

7.3.4 洗胶与干胶 183

7.3.5 离子强度、缓冲能力和导电性 184

7.3.6 电内渗 184

7.3.7 蛋白质的可溶性和添加剂 185

7.3.8 盐对固相pH梯度等电聚焦的影响 186

7.3.9 电参数 187

7.3.10 等电点的实验测定 188

7.3.11 与质谱联用 188

7.3.12 电泳过程中出现的问题和解决方法 189

7.4 等电聚焦技术的进展 189

7.4.1 第一代等电聚焦 190

7.4.2 第二代等电聚焦 190

7.4.3 第三代等电聚焦 190

7.4.4 第四代等电聚焦 191

参考文献 191

第8章 双向电泳 195

8.1 原理 195

8.1.1 O'Farrell系统——ISO-DALT系统 197

8.1.2 IPG-DALT系统 198

8.2 方法 199

8.2.1 ISO-DALT方法 199

8.2.1.1 等电聚焦凝胶的准备 199

8.2.1.2 样品准备和加样 199

8.2.1.3 等电聚焦 199

8.2.1.4 pH梯度的测定 200

8.2.1.5 平衡 200

8.2.1.6 SDS凝胶的准备 200

8.2.1.7 二向间的转移 200

8.2.1.8 SDS电泳 200

8.2.1.9 检测 200

8.2.2 IPG-DALT方法 201

8.2.2.1 固相pH梯度凝胶或凝胶条的准备 201

8.2.2.2 IPG凝胶干胶条的再水化（泡胀）&.. 202

8.2.2.3 样品制备 203

8.2.2.4 等电聚焦 204

8.2.2.5 pH梯度的测定 206

8.2.2.6 平衡 206

8.2.2.7 SDS电泳 206

8.2.2.8 检测 207

8.2.2.9 蛋白斑点的后续分析 208

8.3 实验考虑 209

8.3.1 双向电泳的次序 209

8.3.2 非平衡pH梯度电泳（NEPHGE） 209

8.3.3 管状、垂直与水平方式的比较 209

8.3.4 ISO-DALT和IPG-DALT 212

8.3.5 用一个省时、省材料的技术路线起始双向电泳实验 213

8.3.6 变性剂、去污剂和还原剂 213

8.3.7 样品的处理 215

8.3.7.1 破碎 215

8.3.7.2 防止蛋白质水解 216

8.3.7.3 沉淀蛋白 218

8.3.7.4 清除污染物 219

8.3.7.5 样品制备中的多级分离 224

8.3.8 聚焦参数 224

8.3.9 IPG-DALT系统第一向电泳时的油层覆盖 224

8.3.10 二向间的平衡和转移 225

8.3.11 双向电泳蛋白质标准 226

8.3.12 点的延长和扩散 227

8.3.13 纹理现象 227

8.3.14 荧光染色 227

8.3.15 在双向凝胶电泳中的荧光差异技术 228

参考文献 232

第9章 滴定曲线 237

9.1 概念 237

9.2 方法 239

9.3 实验考虑 240

9.3.1 在8mol/L尿素和去污剂中的滴定曲线 240

9.3.2 大分子的滴定曲线 240

9.3.3 用琼脂糖作为支持介质 240

参考文献 241

第10章 免疫电泳 242

10.1 原理 242

10.1.1 免疫电泳基础 242

10.1.2 单免疫扩散-Mancini技术 243

10.1.3 双扩散-Ouchterlony技术 243

10.1.4 Grabar和Williams免疫电泳 245

10.1.5 “火箭”免疫电泳 245

10.1.5.1 Laurell“火箭”免疫电泳 245

10.1.5.2 融合“火箭”免疫电泳 246

10.1.6 交叉免疫电泳 247

10.1.6.1 Clarke和Freeman交叉免疫电泳 247

10.1.6.2 串联交叉免疫电泳 248

10.1.7 反向免疫电泳 248

10.2 方法 248

10.2.1 溶液的准备 248

10.2.2 倒胶 249

10.2.3 打孔与加样 249

10.2.4 电泳 249

10.2.5 检测 249

10.3 实验考虑 250

10.3.1 支持介质 250

10.3.2 缓冲系统 250

10.3.3 抗体和抗血清 250

10.3.4 方法的选择 251

10.3.5 “Laying-on”技术 251

10.3.6 媒介凝胶技术 251

10.3.7 免疫沉淀的观察 252

参考文献 253

第11章 蛋白质印迹 255

11.1 原理 255

11.1.1 几种印迹方法 256

11.1.1.1 点印迹 256

11.1.1.2 扩散印迹 256

11.1.1.3 溶剂流印迹 257

11.1.1.4 电泳印迹 257

11.1.2 固定化材料 258

11.1.2.1 硝化纤维素膜 258

11.1.2.2 尼龙膜 259

11.1.2.3 DBM和DPT纸 259

11.1.2.4 PVDF膜 259

11.1.3 转移缓冲液 260

11.1.4 封阻、标记和检测 260

11.2 方法 261

11.2.1 从SDS凝胶上转移蛋白质 261

11.2.1.1 溶液配置 261

11.2.1.2 转移单元的组成 261

11.2.1.3 电参数 262

11.2.2 从琼脂糖凝胶上转移蛋白质 262

11.2.2.1 溶液配置 262

11.2.2.2 转移单元的组成 262

11.2.2.3 电参数 262

11.2.3 从等电聚焦凝胶上转移蛋白质 262

11.2.3.1 溶液配置 262

11.2.3.2 转移单元的组成 262

11.2.3.3 电参数 262

11.2.4 检测 263

11.3 实验考虑 263

11.3.1 电泳转移的效率 263

11.3.2 转移缓冲液 263

11.3.3 封阻 264

11.3.4 探针 265

11.3.5 总蛋白染色 266

11.3.6 转移膜的塑料包埋和透明化 267

11.3.6.1 溶液和材料 267

11.3.6.2 操作 268

11.3.7 垂直槽式和水平半干式电泳印迹 268

11.3.8 印迹过程中出现的问题及解决办法 268

参考文献 270

第12章 制备电泳 274

12.1 洗脱 274

12.1.1 扩散洗脱 274

12.1.2 电泳洗脱 274

12.2 连续电泳 275

12.2.1 连续洗脱电泳 275

12.2.2 连续自由流动电泳 275

12.2.3 空间电泳 275

12.3 等电聚焦制备电泳 275

12.3.1 液体介质 275

12.3.2 凝胶介质 276

12.3.3 方法 276

12.3.4 实验考虑 278

12.3.5 固相pH梯度制备等电聚焦 278

12.4 样品的均一性 279

参考文献 279