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第七章基因的表达与调节 1

第一节概述 1

目 录 1

第二节原核基因的表达与调节 4

1．大肠杆菌基因组结构概述 4

（1）基因组结构 4

（2）操纵子 5

（3）基因表达信号 6

2．大肠杆菌基因的转录 6

（1）转译的概述 （1 7

（1）RNA合成的化学特性 7

（2）RNA合成的不同阶段 8

（3）转录终止的类型 11

（4）RNA分子的类型 15

3．大肠杆菌基因的转译 17

（2）转译的三个步骤 19

（3）转译的调节 23

（4）mRNA稳定性的转译效应 25

4．大肠杆菌基因表达的调节 26

（1）转录调节的特点 26

（2）大肠杆菌基因表达的诱导与阻遏 27

（3）大肠杆菌基因表达的正调节与负调节 28

（4）大肠杆菌基因表达的操纵子模型 29

（5）弱化作用调节 38

第三节真核基因组及基因的结构 41

（1）染色质的组分 42

1．染色质与染色体 42

（2）核小体 43

（3）核小体结构的修饰 44

（4）活性染色质与转录 44

（5）染色体 46

2．真核基因组的结构 47

（1）蛋白质编码基因 48

（2）遗传元件 49

（3）转位子与内源性反转录病毒 50

（4）卫星DNA 52

（5）DNA重排 52

（6）DNA扩增 54

3．真核基因的结构 55

（1）polⅠ基因 56

（2）polⅢ基因 57

（3）polⅡ基因 60

第四节真核基因的转录与调节 65

1．真核RNA聚合酶与基因转录 65

（1）RNA聚合酶的类型 65

（2）真核mRNA的结构特征 66

（3）pre-mRNA的剪辑 68

（4）mRNA的稳定性 68

2．真核基因启动子 71

（1）启动子元件的鉴定 71

（2）启动子的结构模型 74

3．增强子的功能特性 75

（1）增强子的一般特性 75

（2）细胞专一性增强子 76

（3）调节型增强子 77

（1）调节的水平 78

4．真核基因转录调节的若干问题 78

（2）转录的控制 79

（3）转录的激活 80

（4）转录的抑制 82

5．真核基因转录的激素调节 82

（1）类固醇激素对真核基因转录的激活效应 82

（2）类固醇激素激活真核基因转录的分子机理 84

6．真核基因转录的甲基化调节 86

（1）DNA甲基化的转录效应 86

（2）甲基化作用的克隆遗传 87

第五节转录因子的结构与功能 88

1．转录因子的概述 88

（1）转录因子的组件结构特性 90

2．转录因子的结构 90

（2）DNA结合域 92

（3）转录激活域 96

3．转录因子的纯化与克隆 97

（1）应用DNA亲和层析法纯化转录因子 98

（2）应用DNA识别位点亲和层析法纯化转录因子 98

（3）应用基因克隆技术纯化转录因子 102

4．转录因子克隆基因的应用 103

（1）阐释转录因子的特性 103

（2）制备大量的转录因子蛋白质 103

（3）转录因子DNA结合域定位 103

（4）转录因子DNA结合域的突变研究及其基序的鉴定 105

（5）转录因子激活域的鉴定——结构域交换试验 105

（1）转录因子的激活效应 107

5．转录因子的功能作用 107

（2）转录因子的抑制效应 109

第八章真核基因在大肠杆菌中的表达 112

第一节真核基因的大肠杆菌表达体系 112

1．大肠杆菌表达体系 112

2．克隆基因正确表达的基本条件 113

3．克隆基因表达活性的检测 114

第二节大肠杆菌的表达载体 116

1．大肠杆菌表达载体的基本成分 116

（1）启动子 116

（2）转录终止子 117

（1）分离功能启动子的一般程序 119

2．功能启动子的分离 119

（5）转译终止子 119

（4）转译增强子 119

（3）转译起始序列 119

（2）使用tet作报告基因分离功能启动子 120

（3）使用galK作报告基因分离功能启动子 122

3．常用的大肠杆菌表达载体 126

（1）lac启动子的表达载体 126

（2）trp启动子的表达载体 128

（3）PL启动子的表达载体 131

第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达 135

1．外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 135

（1）细胞质中表达 135

（2）周质中表达 137

（3）胞外表达 137

2．融合蛋白质的表达 138

（1）融合蛋白质配偶体 139

（2）表达融合蛋白质的策略 139

（3）表达融合蛋白质策略的优点 142

（4）融合蛋白质的纯化 142

（5）融合蛋白质的切割 144

3．外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性 148

（1）蛋白质的酶解作用 150

（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性 151

（3）表达部位与蛋白质的稳定性 152

（4）表达天然的蛋白质 152

（5）分子伴侣的稳定作用 153

第四节 影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素 154

（6）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性 154

1．5′UTR对克隆基因表达效率的影响 155

（1）启动子结构对表达效率的影响 155

（2）启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响 155

（3）提高克隆基因表达效率的实验方案 157

2．质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响 158

（1）质粒载体的拷贝数对表达效率的影响 158

（2）质粒载体的不稳定性对表达效率的影响 161

3．mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响 163

（1）转译起始序列对表达效率的影响 163

（2）mRNA的稳定性对表达效率的影响 164

4．遗传密码子的使用对基因表达效率的影响 167

（1）密码子使用的偏爱性 167

（3）密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响 168

（2）密码子使用偏爱性的原因 168

5．寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响 169

第九章植物基因工程 171

第一节植物基因的克隆与分离 173

1．根据基因的功能分离目的基因 174

2．根据mRNA特异性分离目的基因 174

3．根据DNA的插入作用分离目的基因 177

（1）转位子标签法 177

（2）T-DNA标签法 180

第二节植物基因工程研究常用的基因 183

1．选择标记基因 183

（1）新霉素磷酸转移酶基因 185

2．报告基因 186

（2）bar基因 186

（1）报告基因的应用 187

（2）常用的报告基因 188

3．抗虫基因 191

（1）微生物源的抗虫基因 192

（2）植物源的抗虫基因 195

（3）动物源的抗虫基因 201

4．抗病基因 201

（1）抗病毒基因 201

（2）抗细菌基因 206

（3）抗真菌基因 209

（4）植物抗病的分子机理 211

5．非生物胁迫的抗性基因 218

（1）重金属抗性基因 218

（2）抗盐基因 219

（3）抗低温胁迫基因 221

（4）抗除草剂基因 222

（5）抗氧化胁迫基因 224

第三节植物基因转移的病毒载体 225

1．单链RNA植物病毒 225

2．单链DNA植物病毒 227

（1）双子座病毒组病毒的一般生物学特性 227

（2）番茄金色花叶病毒作为植物基因转移载体的可能性 228

3．双链DNA植物病毒 229

（1）花椰菜花叶病毒组的一般生物学特性 231

（2）CaMV DNA的特性 232

（3）CaMV的生活史模式 233

4．花椰菜花叶病毒DNA载体 234

（2）DNA的缺失或插入与CaMV的感染性 235

（1）CaMV DNA的表达 235

（3）CaMV克隆载体的发展 236

（4）CaMV DNA作为克隆载体的评价 237

第四节植物基因转移的质粒载体 238

1．病原土壤杆菌 238

2．植物冠瘿的诱发与冠瘿细胞的特性 240

3．Ti质粒的遗传特性 241

（1）冠瘿瘤诱发之遗传本质 241

（2）Ti质粒的遗传功能 244

（3）以Ti质粒为媒介的接合转移 245

（4）Ti质粒的限制图及基因图 246

4．T-DNA的结构与功能 247

（1）Ti质粒与T-DNA 247

（2）T-DNA的整合机理 247

（3）T-DNA的编码基因及功能 250

5．Ti质粒载体的构建 251

（1）T-DNA转化的选择记号 251

（2）共合载体法 252

（3）双元载体系统 255

（4）隔端载体法 257

6．Ri质粒载体系统 260

第五节培育转基因植物的实验方法 261

1．根瘤土壤杆菌的转化 261

（1）两步接合转移法 262

（2）三亲株杂交转移法 262

2．植物细胞的转化 263

（1）根瘤土壤杆菌介导的植物细胞转化法 263

（3）其它方法 271

（2）生物弹击法 271

3．转基因植株的再生 273

（1）愈伤组织培养 274

（2）原生质体培养 274

第六节转基因植物中外源基因的表达与调节 278

1．高等植物基因表达调节概述 278

（1）高等植物基因表达的类型 278

（2）叶绿体基因的表达与调节 279

（3）花发育过程中基因的表达与调节 281

（4）植物激素与发育调节 281

2．转基因沉默及其机理 282

（1）转基因沉默的分子机理 283

（2）转基因沉默的模式 285

（4）基质附着区的功能 286

（3）DNA甲基化与转基因沉默 286

4．提高转基因表达水平的若干技术途径 287

（1）启动子及终止子的修饰与改造 287

3．环境因素对转基因表达活性的影响 287

（2）转基因的修饰与改造 288

（3）使用植物偏爱的密码子 289

（4）蛋白质的定向运输 290

第十章哺乳动物基因工程 291

第一节哺乳动物基因转移的遗传选择标记 291

1．嘌呤和嘧啶的生物合成 291

2．胸苷激酶基因选择系统 293

（1）TK－细胞 293

（2）HAT选择法 293

（3）共转化选择 294

（1）基本原理 296

3．二氢叶酸还原酶基因选择系统 296

（2）主要优点 297

（3）显性选择 298

4．氯霉素乙酰转移酶基因选择系统 298

（1）CAT质粒载体 298

（2）CAT酶活性的测定 299

5．黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因选择系统 299

（1）基本原理 299

（2）pSV2及其派生的质粒载体 301

（3）pRSV及其派生的质粒载体 303

6．氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统 303

（2）影响磷酸钙转染效率的因素 305

（1）磷酸钙转染的基本步骤 305

1．磷酸钙转染技术 305

第二节 外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 305

2．DEAE葡聚糖转染技术 308

（1）DEAE－葡聚糖转染的一般程序 308

（2）DEAE－葡聚糖转染的可能机理及影响因素 308

（3）DEAE－葡聚糖转染法的评价 308

3．聚阳离子－DMSO转染技术 309

4．基因显微注射技术 309

（1）显微注射法 309

（2）穿刺法 310

5．电穿孔DNA转移技术 310

（1）基本原理 310

（2）操作程序 310

6．脂质体载体法 311

（3）影响因素 311

（1）脂质体的制备 312

（2）脂质转染法 312

（3）脂质体载体法的优越性 312

7．哺乳动物细胞基因打靶 314

（1）基因打靶的分子基础 314

（2）基因打靶的类型与应用 315

（3）正负选择法 316

（4）一触即脱选择法 318

（5）哺乳动物细胞基因剔除实验 318

第三节SV40病毒载体 320

1．SV40病毒的基本生物学特性 321

（1）SV40病毒的生命周期 321

（2）SV40病毒的基础分子生物学 322

（3）SV40病毒的增强子序列 323

2．取代型重组病毒载体 323

（1）晚期区段取代载体 324

（2）早期区段取代载体 328

3．重组的病毒－质粒载体 329

（1）含有完整早期区段和复制起点的病毒－质粒载体 329

（2）微型病毒复制子－质粒载体 330

第四节反转录病毒载体 332

1．反转录病毒的一般生物学特性 332

（1）生命周期 332

（2）反转录病毒基因组的特点 333

（3）反转录病毒的复制 335

（4）原病毒DNA的表达 336

2．反转录病毒载体的主要类型 338

（1）辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 338

（2）不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 339

（3）广寄主的反转录病毒载体 342

（4）反转录病毒表达载体 342

第五节其它的病毒载体 344

1．痘苗病毒载体 344

（1）痘苗病毒的特性 344

（2）痘苗病毒载体的构建 344

2．乳头瘤病毒载体 346

（1）牛乳头瘤病毒基因组的结构特点 347

（2）牛乳头瘤病毒载体 347

3．腺病毒载体 349

（1）腺病毒的一般生物学特性 350

（2）腺病毒载体的构建 351

第十一章重组DNA与现代生物技术 352

第一节若干重大农业生产问题的探索 352

1．提高光合作用效率的基因工程基础研究 352

（1）光合作用概述 352

（2）光合作用基因工程的主要目标 354

（3）叶绿体基因组的转化 356

2．生物固氮与固氮基因转移 360

（1）根瘤菌的固氮作用 360

（2）固氮酶复合体 363

（3）生物固氮的基因工程 364

3．农作物产品质量的修饰 365

（1）改善脂肪酸的质量 365

（2）提高种子蛋白的营养价值 367

（3）延迟水果的成熟期 369

（4）修饰淀粉的成分 371

第二节重组DNA技术与药品制造业 373

1．重组疫苗 374

（1）疫苗的设计 375

（2）重组亚基疫苗 375

（3）重组病毒活疫苗 377

2．抑生长素 379

（1）抑生长素基因的化学合成 380

（2）抑生长素基因的克隆策略 380

（3）克隆抑生长素基因的意义 383

3．胰岛素 384

（1）合成重组人胰岛素的第一种策略 386

（2）合成重组人胰岛素的第二种策略 388

4．干扰素 389

（1）淋巴因子 389

（2）人干扰素的功能及其作用的分子机理 390

（3）人干扰素的基因工程 391

5．人生长激素 392

（1）人生长激素的生理功能 392

（2）重组人生长激素的生产 394

（3）重组人生长激素的改良 396

第三节重组DNA技术在工业生产中的应用 396

1．纤维素的开发利用 396

（1）纤维素的生物降解 397

（2）纤维素酶基因的分离 398

（3）纤维素酶基因工程 400

2．食品工业 401

（1）乳制品发酵 401

（2）单细胞蛋白质 402

（3）酿酒工业 403

3．新型抗菌素的生产 404

（1）聚酮类抗菌素的合成 405

（2）新型抗菌素的合成 406

（3）聚酮类抗菌素的突变改造 407

第四节蛋白质工程 407

1．生产新型蛋白质的途径 407

（1）应用化学合成和修饰法生产工程蛋白质 408

（2）应用化学合成的DNA序列表达工程蛋白质 408

（3）应用基因定点诱变技术生产新型蛋白质 408

（4）应用随机诱变技术生产新型蛋白质 410

（5）应用蛋白质连接酶生产新型蛋白质 411

2．蛋白酶工程 411

（1）组织纤溶酶原激活物的定点改造 411

（2）a1－抗胰蛋白酶的定点改造 412

（3）枯草蛋白酶的定点改造 413

3．抗体工程 414

（1）抗体特异性的分子基础 414

（2）单克隆抗体 416

（3）重组的单克隆抗体 418

（4）人源化的单克隆抗体 421

（5）双特异性的单克隆抗体 423

第五节环境生物技术学 423

（1）生物降解塑料 424

1．塑料污染的生物防治 424

（2）应用转基因植物生产生物降解塑料 426

2．农药污染的生物防治 429

（1）五氯苯酚污染的生物防治 430

（2）除草剂污染的生物防治 431

（3）有机磷污染的生物防治 432

3．石油污染的生物防治 435

第十二章重组DNA与医学研究 438

第一节癌症研究 438

1．癌基因 438

（1）病毒癌基因 438

（2）细胞癌基因 441

2．肿瘤抑制基因 443

（1）存在肿瘤抑制基因的实验证据 443

（2）肿瘤抑制基因的功能作用 444

（3）p53肿瘤抑制基因 445

（4）RBl肿瘤抑制基因 446

3．细胞癌化 446

（1）蛋白质激酶 447

（2）ras族癌基因 448

（3）myc族癌基因 448

4．癌症的基因治疗 449

（1）转录因子诱捕法 449

（5）反义基因阻断治疗法 450

1．艾滋病与HIV病毒 450

第二节艾滋病研究 450

（4）肿瘤抑制基因治疗法 450

（3）自杀基因治疗法 450

（2）RNA转染法 450

（1）HIV病毒的起源 451

（2）HIV病毒的变异性 452

（3）HIV病毒的感染与治疗 453

2．HIV-1病毒基因组的结构 455

（1）tat基因 456

（2）rev基因 457

（3）nef基因 459

（4）其它基因 460

3．HIV疫苗的研制 460

（1）制约HIV疫苗研制的困难因素 460

（2）HIV疫苗研制的现状 461

（3）展望 463

1．遗传与疾病 464

第三节遗传性疾病的基因诊断与治疗 464

2．遗传性疾病的基因诊断 465

（1）遗传性疾病的核酸探针检测法 465

（2）遗传性疾病的产前诊断 466

（3）胎儿的DNA分析 467

3．遗传性疾病的基因治疗 468

（1）基因治疗的转基因载体 468

（2）基因打靶与基因治疗 470

（3）基因治疗的若干病例 471

第四节DNA疫苗 474

1．DNA疫苗的概述 474

（1）DNA疫苗的构成 474

（3）DNA疫苗的优越性 475

（2）DNA疫苗的作用机理 475

2．DNA疫苗的优化 476

（1）DNA载体的优化 476

（2）抗原编码序列的优化 478

（3）免疫佐剂的应用 478

3．DNA疫苗的导入方式 479

（1）基因枪法 479

（2）脂质体法 479

（3）减毒有机体法 480

4．DNA疫苗的安全性 480

5．结论 481

附录名词术语解释 482

参考文献 506

索引 519

后记 536