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第1章 绪论 1

1.1 基因与基因工程 1

1.1.1 基因的概念 1

1.1.2 基因工程与生物工程的关系 2

1.2 基因工程的操作和应用 3

1.2.1 基因工程的操作流程 3

1.2.2 基因工程的应用 3

参考文献 8

第2章 生物大分子 9

2.1 蛋白质的结构 9

2.1.1 蛋白质的一级结构 9

2.1.2 蛋白质的二级结构 10

2.1.3 蛋白质的三级结构 11

2.2 核酸的结构 12

2.2.1 核苷酸 12

2.2.2 DNA的结构 12

2.2.3 RNA的结构 14

2.3 蛋白质和核酸的性质 16

2.3.1 蛋白质的性质 16

2.3.2 核酸的性质 16

2.4 大分子间的信息传导 17

2.4.1 DNA的复制 18

2.4.2 遗传信息的转录 18

2.4.3 RNA的翻译 22

参考文献 25

第3章 DNA的提取与纯化 27

3.1 碱抽提法提取DNA 27

3.1.1 碱抽提法所用各类试剂的生化作用 27

3.1.2 碱抽提法抽提DNA过程中应注意的问题 29

3.2 提取DNA的其他方法 30

3.2.1 质粒DNA的分离纯化 30

3.2.2 基因组或其他DNA的抽提 40

3.3 DNA的定量和纯度测定 44

3.3.1 紫外光谱分析法 45

3.3.2 EB荧光分析法 45

3.3.3 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 46

参考文献 48

第4章 目的基因的获得 50

4.1 基因文库的构建 50

4.2 cDNA的合成和克隆 52

4.2.1 mRNA的提取及其完整性的确定 53

4.2.2 cDNA的合成与克隆 54

4.3 化学法合成目的基因 57

4.3.1 磷酸二酯法 57

4.3.2 亚磷酸三酯法 58

4.3.3 寡核苷酸连接法 58

参考文献 59

第5章 基因扩增 61

5.1 PCR技术 61

5.1.1 PCR技术的发明 61

5.1.2 PCR技术的原理 61

5.1.3 PCR技术的特点 63

5.2 聚合酶链式反应的最适条件 64

5.2.1 Taq DNA聚合酶 64

5.2.2 引物 68

5.2.3 模板 69

5.2.4 dNTP 70

5.2.5 Mg2+浓度 70

5.2.6 PCR系统中的其他成分 70

5.2.7 PCR的热循环计划 70

5.3 聚合酶链反应技术的研究应用 71

5.3.1 基因组克隆 72

5.3.2 反向PCR与染色体步移 73

5.3.3 不对称PCR与DNA序列测定 73

5.3.4 RT-PCR与RNA分析 74

5.3.5 基因的体外诱变与突变的检测 75

5.3.6 基因组的比较研究 76

参考文献 76

第6章 基因的体外重组 78

6.1 限制性核酸内切酶 78

6.1.1 寄主的限制和修饰现象 78

6.1.2 限制性核酸内切酶的类型 79

6.1.3 限制性核酸内切酶的命名 84

6.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素 85

6.1.5 限制性核酸内切酶对DNA的消化作用 86

6.1.6 限制性核酸内切酶反应的终止 87

6.2 克隆载体 88

6.2.1 质粒载体 88

6.2.2 噬菌体载体 100

6.2.3 柯斯质粒载体 114

6.3 DNA的连接 118

6.3.1 大肠杆菌和T4噬菌体的DNA连接酶 118

6.3.2 DNA片段在体内和体外的连接 120

6.3.3 平齐末端的连接 121

6.3.4 影响连接反应的因素 124

参考文献 125

第7章 基因的转移与重组体的检测 127

7.1 重组体向寄主细胞的导人 127

7.1.1 重组体DNA分子的转化或转染 127

7.1.2 体外包装的λ噬菌体的转导 129

7.2 重组体克隆的筛选与鉴定 130

7.2.1 遗传检测法 130

7.2.2 物理检测法 135

7.2.3 核酸杂交筛选法 136

7.2.4 免疫化学检测法 139

7.2.5 DNA-蛋白质筛选法 144

7.2.6 转译筛选法 144

参考文献 146

第8章 克隆基因的表达 148

8.1 外源基因在原核细胞中的表达 148

8.1.1 原核生物基因表达的特点 148

8.1.2 基因表达的调控序列 149

8.1.3 几种类型的原核表达载体 154

8.1.4 提高克隆基因表达效率的途径 156

8.2 外源基因在真核细胞中的表达 164

8.2.1 真核细胞基因克隆载体 164

8.2.2 哺乳动物基因转移的选择标记 171

8.2.3 外源基因导入真核细胞的方法 172

参考文献 176

第9章 酵母的基因工程 179

9.1 酵母基因的克隆 179

9.1.1 利用大肠杆菌突变互补法克隆酵母生物合成基因 179

9.1.2 穿梭质粒在大肠杆菌和酵母中的复制 179

9.1.3 用简单的互补法克隆酵母基因 181

9.2 以酵母为材料对真核生物功能的研究 183

9.2.1 酵母的同源重组 183

9.2.2 酵母基因与高等生物基因具有相似的信号途径 185

9.2.3 用酵母遗传实验解答某些生化难题 188

9.2.4 用酵母遗传分析鉴别和研究高等生物基因 190

参考文献 192

第10章 植物的基因工程 193

10.1 再生植株 193

10.1.1 植物在遗传工程方面的优缺点 193

10.1.2 单个细胞可生长成完整植株 194

10.1.3 用叶盘再生植株 195

10.2 植物基因转移的途径 195

10.2.1 土壤农癌杆菌的Ti质粒引起冠瘿瘤 195

10.2.2 Ti质粒的T-DNA部分转移至植物细胞 196

10.2.3 T-DNA经过改造后作为基因载体 197

10.2.4 用报告基因证明转移基因在植物组织中的表达 199

10.2.5 病毒可用作所有植物基因转移的载体 200

10.2.6 用基因枪和电击法将DNA转移入植物细胞 201

10.2.7 用DNA包裹的粒子轰击可产生转基因细胞器 203

10.3 植物基因的表达 204

10.3.1 植物表达抗感染的病毒外壳蛋白 204

10.3.2 植物表达微生物毒素以阻止昆虫蚕食 205

10.3.3 抗除草剂植物 207

10.3.4 转基因花卉植物 208

10.3.5 利用转基因植物生产有重要价值的蛋白质 208

参考文献 209

第11章 哺乳动物的基因工程 211

11.1 将基因转移入哺乳动物细胞 211

11.1.1 永久性细胞系的建立使基因转移变得实际 211

11.1.2 基因转移首先用于对肿瘤病毒的研究 212

11.1.3 在哺乳动物细胞中起作用的选择性标记使得可通过共转染进行基因转移 213

11.1.4 外源DNA在转染入细胞后的瞬时表达 216

11.1.5 用基因扩增使蛋白质高水平表达 217

11.1.6 应用于特殊细胞类型的转染方法 218

11.1.7 用病毒载体将外源DNA引入细胞 219

11.1.8 牛痘病毒和杆状病毒用于蛋白质的高水平表达 221

11.1.9 逆转录病毒作为基因转移的高效载体 222

11.2 转基因小鼠 224

11.2.1 外源基因整合人受体动物的染色体 225

11.2.2 外源DNA可稳定地整合人生殖系细胞 225

11.2.3 胚胎干细胞可携带外源基因 226

11.2.4 可调节转基因的组织特异性模式 228

11.2.5 转基因可在特异性组织定向表达 228

11.2.6 转基因可用以杀死特异性细胞类型 228

11.2.7 用反转录病毒追踪细胞来源 229

11.2.8 转基因可扰乱内源性基因的功能 229

11.2.9 通过同源重组进行基因剔除能说明基因系统的复杂性 230

11.3 转基因家畜 231

11.3.1 重组牛生长激素促进动物泌乳和改善饲料利用率 231

11.3.2 转基因家畜 231

11.3.3 用转基因动物生产药物蛋白 232

11.3.4 通过转基因表达病毒外壳蛋白以保护家畜免受病毒感染 233

参考文献 233

第12章 医药工业的基因工程 236

12.1 利用基因工程技术生产胰岛素和生长激素 236

12.1.1 生产重组蛋白的表达系统有了很大改进 236

12.1.2 胰岛素是第一个获准用于人类疾病治疗的重组体药物 237

12.1.3 通过两种方法生产人的重组生长激素 238

12.2 利用基因工程技术生产疫苗和其他复杂蛋白质 240

12.2.1 乙型肝炎病毒疫苗的生产 240

12.2.2 用哺乳类培养细胞大规模生产人的复杂蛋白质 241

12.3 利用基因工程技术生产抗体 243

12.3.1 单克隆抗体 243

12.3.2 对识别特异性抗原的抗体直接克隆和选择 244

12.3.3 人源化单克隆抗体保持免疫活性但失去免疫原性 245

12.3.4 蛋白质工程使抗体具有特殊用途 246

参考文献 247