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第1章 绪论 1

1.1 基因工程的诞生 2

1.1.1 理论上的三大发现 2

1.1.2 技术上的三大发明 4

1.2 基因工程的定义及主要研究内容 6

1.2.1 基因工程的定义 6

1.2.2 基因工程的主要研究内容 8

1.3 基因工程的发展概况 9

1.4 基因工程的安全性问题 12

第2章 基因工程的基本技术 14

2.1 核酸分子的提取 14

2.1.1 总DNA的提取 15

2.1.2 RNA的提取 16

2.1.3 质粒DNA的提取 18

2.2 电泳技术 21

2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 22

2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 25

2.2.3 脉冲电泳凝胶电泳 26

2.3 基因的分子克隆 27

2.3.1 基因克隆所需的核酸酶 27

2.3.1.1 核酸内切限制酶 29

2.3.1.2 DNA连接酶 32

2.3.1.3 DNA聚合酶 33

2.3.1.4 DNA分子克隆中所使用的其他工具酶 34

2.3.2　基因克隆的主要载体类型 35

2.3.2.1 质粒载体 35

2.3.2.2 噬菌体载体 39

2.3.2.3 柯斯质粒载体 44

2.3.2.4 单链DNA噬菌体载体 45

2.3.2.5 噬菌粒载体 48

2.3.2.6 真核细胞的克隆载体 50

2.3.3 DNA的体外重组 51

2.3.3.1 外源DNA片断同载体分子的重组 51

2.3.3.2 重组体分子导入受体细胞的途径 54

2.4 重组体的筛选与鉴定 56

2.4.1 遗传检测法 56

2.4.1.1 根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法 56

2.4.1.2 根据插入序列的表型特征选择重组分子的直接选择法 57

2.4.2 物理检测法 58

2.4.2.1凝胶电泳检测法 58

2.4.2.2 R-环检测法 58

2.4.3 菌落或噬菌斑杂交筛选法 59

2.4.4 免疫化学检测法 60

2.4.5 DNA-蛋白质筛选法 60

2.4.6 转译筛选法 61

2.4.6.1 杂交抑制的转译 61

2.4.6.2 杂交选择的转译 61

第3章 目的基因的分离 63

3.1 基本概念 64

3.1.1 cDNA文库 64

3.1.1.1 cDNA文库构建的基本步骤 64

3.1.1.2 cDNA表达文库 65

3.1.2 基因组文库 66

3.1.2.1 λ噬菌体载体构建基因组文库的步骤 67

3.1.2.2 柯斯质粒构建基因组文库及其优缺点 68

3.1.3 PCR技术 69

3.2 根据特异蛋白分离目的基因 71

3.3 根据奇异mRNA分离目的基因 72

3.3.1 差别杂交 72

3.3.1.1 差别杂交的原理 72

3.3.1.2 差别杂交技术的局限性 73

3.3.2 mRNA减法杂交技术 74

3.3.2.1 减法杂交的原理 74

3.3.2.2 减法杂交技术的优缺点 76

3.3.3 mRNA差别显示技术 76

3.3.3.1 mRNA差别显示技术的一般原理 77

3.3.3.2 mRNA差别显示技术的优越性及应用 78

3.3.3.3 mRNA差别显示技术的缺陷 79

3.3.4 cDNA代表性差别分析技术 80

3.3.4.1 cDNA代表性差别分析技术原理 80

3.3.4.2 代表性差别分析技术的操作流程 80

3.3.4.3 代表性差别分析技术的优缺点 82

3.3.5 抑制性减法杂交技术 82

3.3.5.1 抑制性减法杂交技术的原理 82

3.3.5.2 抑制性减法杂交技术的操作流程 84

3.3.5.3 抑制性减法杂交技术的优缺点 85

3.4 利用DNA插入法分离目的基因 86

3.4.1 转位子标签法 86

3.4.1.1 转位子标签法的一般概念 86

3.4.1.2 转位子标签法分离基因的程序 88

3.4.1.3 转位子标签法的局限性 90

3.4.2 T-DNA标签法 90

3.5 染色体步行法分离目的基因 91

3.5.1 染色体步行法的基本原理 91

3.5.2 染色体步行法的基本操作步骤 91

3.6 表达序列标签法分离目的基因 92

3.6.1 表达序列标签法的定义 92

3.6.2 表达序列标签法分离基因的基本步骤 92

3.6.3 表达序列标签法的应用 92

3.7 基因表达系列分析法 93

3.7.1 基因表达系列分析法的原理 93

3.7.2 基因表达系列分析法的具体过程 94

3.8 酵母双杂合系统 94

3.8.1 酵母双杂合系统的原理及应用 95

3.8.2 酵母双杂合系统的实验程序 95

3.8.3 酵母双杂合系统分离目的的基因的优缺点 97

3.9 目的基因的分离方法总结 97

第4章 克隆基因的表达体系 99

4.1 表达体系与表达产物 99

4.2 大肠杆菌表达体系 100

4.2.1 原核生物基因表达的特点 100

4.2.2 外源基因在原核细胞中表达的调控元件 100

4.2.2.1 启动子 100

4.2.2.2 SD序列 101

4.2.2.3 终止子 102

4.2.3 几种类型的原核表达载体 102

4.3 提高外源基因表达水平的措施 103

4.4 植物表达体系与植物基因工程 103

4.4.1 植物基因工程的目的基因 104

4.4.2 植物基因工程的载体--Ti质粒 106

4.4.2.1 Ti质粒的遗传特性、结构及功能 106

4.4.2.2 T-DNA的结构与功能 107

4.4.2.3 Vir区操纵子的基因结构与功能 108

4.4.2.4 植物基因转化的载体系统 108

4.4.3 植物组织培养与基因转化的受体系统 109

4.4.4 植物基因工程中常用的报告基因 110

4.4.5 植物基因转化方法 112

4.4.5.1 共培养法 113

4.4.5.2 病毒介导的基因转移 116

4.4.5.3 基因枪法介导的基因转化 119

4.4.5.4 PEG诱导的基因转化 122

4.4.5.5 脂质体介导的基因转化 123

4.4.5.6 电激法介导的基因转化 124

4.4.5.7 超声波介导的基因转化 125

4.4.5.8 显微注射介导的基因转化 125

4.4.5.9 激光微束介导的基因转化 126

4.4.5.10 种质系统介导的基因转化 126

4.4.6 外源基因在转基因植物中的表达调控 127

4.4.6.1 高等植物基因表达调控特点 128

4.4.6.2 转化外源基因的瞬时表达与稳定表达 129

4.4.6.3 DNA序列对转化外源基因的表达调控 130

4.4.6.4 DNA甲基化对转化外源基因表达的调控作用 131

4.4.7 提高转化外源基因表达的策略 132

4.4.8 植物基因工程中存在的问题及新策略 133

4.5 动物表达体系与动物基因工程 135

4.5.1 外源基因导入动物细胞的载体 135

4.5.2 动物基因转移中的遗传选择标记 136

4.5.3 外源DNA导入动物细胞的方法 137

4.5.4 动物的转基因技术及建立途径 137

4.5.5 转基因动物研究中存在的主要问题 140

第5章 转基因技术的应用 141

5.1 转基因技术在医学上的应用 141

5.1.1 基因治疗 142

5.1.1.1 基因治疗的原理 142

5.1.1.2 基因治疗的应用 142

5.1.1.3 基因治疗中所面临的几个问题 143

5.1.2 转基因技术与药用蛋白的生产 143

5.1.2.1 疫苗、抗原、抗体 144

5.1.2.2 药用酶类 145

5.1.2.3 生长因子 145

5.1.2.4 其他药用化合物 146

5.2 转基因技术在农业中的应用 147

5.2.1 转基因农作物 147

5.2.1.1 抗虫农作物 147

5.2.1.2 抗病毒农作物 148

5.2.1.3 抗除草剂农作物 149

5.2.1.4 抗胁迫农作物 149

5.2.1.5 转基因技术与细胞质雄性不育 149

5.2.2 转基因植物与日常生活 150

5.2.2.1 服装 150

5.2.2.2 园艺植物 151

5.2.2.3 食品和饮料 151

5.2.3 转基因动物 153

5.3 转基因技术在环境保护中 的应用 155

5.4 转基因技术在工业中的应用 155

5.4.1 生物能源和燃料 155

5.4.2 木质素和造纸 156

5.4.3 塑料 156

主要参考书目 157