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第一章　细胞培养概述及细胞培养前的准备工作 1

第一节　细胞培养概述 1

资料单 1

一、细胞培养的发展史 1

二、细胞培养的基本概念及优缺点 3

三、细胞培养的作用 4

四、细胞培养实验的基本要求 7

五、与细胞培养相关的专业术语 8

第二节 细胞培养实验室的设置及设备 13

资料单 13

一、细胞培养实验室的设置 14

二、细胞培养实验室的设备 16

技能单1 细胞培养实验室设备的使用、保养和作用 18

一、超净工作台 19

二、培养箱 20

三、倒置显微镜 22

四、冰箱 23

五、干热灭菌箱 23

六、高压蒸汽灭菌器 24

七、离心机 26

八、液氮罐 27

技能单2　认识常用细胞培养的器材 28

一、细胞培养瓶 28

二、培养皿 29

三、多孔培养板 29

四、加样器及吸头 30

五、其他与培养操作有关用品 31

第三节　细胞培养用品的清洗和消毒灭菌 32

资料单 32

一、培养用品的清洗 32

三、培养用品的消毒灭菌 34

二、包装 34

技能单1　清洗液的配制及培养器材的清洗、包装与消毒 38

一、清洗液的配制 38

二、玻璃器皿的清洗、包装、消毒 39

三、橡胶制品的清洗、包装、消毒 42

四、塑料制品的清洗 42

五、器材包装时应注意事项和要求 42

技能单2　正压式除菌滤器及一次性滤器的使用 43

一、正压除菌滤器 43

二、小型针头滤器的使用 44

第二章　细胞培养用液和培养液 46

第一节　细胞培养用液 46

资料单 46

一、水和缓冲溶液 47

二、生理盐水和平衡盐溶液 48

三、其他常用液 49

技能单1 常用BSS液的配制 52

一、Hank's液的配制 52

二、D-Hank's液的配制 53

三、配制BSS液的要求 54

四、Hank's液的作用 54

技能单2　常用细胞消化液的配制 55

一、0.25％胰蛋白酶溶液的配制 55

二、0.02％EDTA的配制 56

三、0.02％EDTA+0.25％胰蛋白酶（1∶1）混合液的配制 56

技能单3　常用抗生素溶液的配制 57

一、青霉素、链霉素（双抗）液 58

二、卡那霉素液 58

三、制霉菌素液 58

资料单 59

一、培养细胞的生长条件 59

第二节　细胞培养液 59

二、培养液（基） 64

技能单1　DMEM培养液的配制 80

一、配方 81

二、合成培养液的配制 81

技能单2　PRMI-1640溶液的配制 83

一、不完全RPMI-1640培养液配方 83

二、合成培养液的配制 83

第三章　细胞培养的基本技术 85

第一节　培养细胞的取材与分离 85

资料单 85

一、培养室内的无菌操作 85

二、培养细胞的取材 87

三、组织材料的分离 89

技能单1　组织的剪切与消化技术 92

技能单2　细胞计数技术 93

技能单3　细胞密度换算 95

第二节　原代培养 96

资料单 96

一、组织块培养法 97

二、消化培养法 98

三、器官培养 99

技能单1　鸡胚原代细胞的培养 100

一、鸡胚的孵育 100

二、鸡胚的发育过程 100

三、操作步骤 101

技能单2　小鼠胎儿细胞的原代培养 103

一、组织块培养法 104

二、消化培养法 105

第三节　传代培养和细胞系的维持 106

资料单 106

二、细胞传代方法 107

一、原代培养的首次传代 107

三、细胞系的维持 109

四、培养细胞的纯化 109

技能单1　细胞传代技术 111

技能单2　培养细胞的纯化 114

一、酶消化法 114

二、反复贴壁法 114

第四节　培养细胞的特性及观察 115

资料单 115

一、培养细胞的生长方式及类型 115

二、培养细胞的生长特点 117

三、培养细胞的生长过程 119

技能单1　培养细胞常规检查 124

一、培养细胞常规检查的意义 124

二、检查营养液pH值 124

三、细胞污染的检查及排除 125

四、健康细胞与衰老死亡细胞的观察 129

技能单2　细胞活性检查 130

一、原理 130

二、配制染色液 130

三、制备细胞悬液 130

四、染色 131

技能单3　培养细胞染色体的染色及观察 132

技能单4　细胞生长曲线的绘制 134

技能单5　细胞的克隆形成实验 135

一、概述 135

二、平板克隆形成实验 136

三、软琼脂克隆形成实验 136

四、平板琼脂克隆培养法 137

五、提高克隆形成率的方法 137

资料单 139

第一节　病毒的结构及生物学特性 139

第四章　病毒的细胞培养技术 139

一、病毒的基本特征 140

二、病毒的形态结构 141

三、毒粒的化学组成 143

四、病毒的复制 145

五、病毒的培养 148

六、病毒的生物学特性 148

第二节　病毒的细胞培养 151

资料单 151

一、细胞培养用于病毒研究的优点 151

二、用细胞培养分离病毒 152

三、用细胞培养法制备病毒血清学抗原 157

技能单1　病毒的细胞培养技术 158

一、制备病毒悬液 158

二、将病毒接种于培养细胞 159

技能单2　观察细胞病变 160

第三节　病毒的鉴定技术 163

资料单 163

一、病毒蚀斑技术 163

二、病毒蚀斑抑制试验 167

三、细胞培养系统中的中和试验 168

技能单1　病毒的蚀斑技术 173

一、配制双层营养琼脂糖 173

二、操作步骤 173

技能单2　单层细胞微量中和试验 175

第五章　细胞冻存、复苏及运输 177

第一节　细胞的冻存 177

资料单 177

一、细胞冻存的意义 177

二、细胞的冻存原理 178

一、培养瓶培养细胞的冻存 179

技能单　细胞冻存技术 179

二、骨髓瘤细胞的冻存 181

第二节　细胞的复苏及运输 182

资料单 182

一、细胞的复苏 183

二、培养细胞的运输 185

技能单　细胞的常规复苏技术 186

第六章　单克隆抗体（McAb）生产技术 188

第一节　杂交瘤技术的概述 188

资料单 188

一、杂交瘤技术发展简史 188

二、杂交瘤技术的概念与分类 189

三、单克隆抗体的概念及特性 189

四、单克隆抗体产生的原理 191

一、抗原的纯度问题 193

二、免疫动物的选择 193

资料单 193

第二节　动物免疫 193

三、免疫 194

技能单　动物免疫技术 197

一、颗粒性抗原的免疫方法 197

二、可溶性抗原的免疫方法 197

第三节 骨髓瘤细胞的准备 199

资料单 199

一、骨髓瘤细胞系的种类 199

二、骨髓瘤细胞系的选择 200

三、骨髓瘤细胞的培养 201

四、血清的筛选 203

技能单　骨髓瘤细胞的复苏及培养观察 204

二、饲养细胞的类型 206

一、饲养细胞及其作用 206

资料单 206

第四节　饲养细胞及其制备 206

技能单　饲养细胞制备技术 207

第五节　细胞融合 209

资料单 209

一、细胞融合 209

二、细胞融合剂的选择 210

技能单1　细胞融合用主要试剂的配制 211

一、不完全RPMI-1640培养液 212

二、完全RPMI-1640培养液 212

三、氨基喋呤（A）贮存液（100x,4×10mol/L） 212

四、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液［100H:10～2mol/L;T:1.6×(10～3)mol/L］ 212

技能单2　制备免疫脾细胞悬液 213

七、50％PEG 213

六、HT培养液 213

五、HAT培养液 213

技能单3　制备骨髓瘤细胞悬液 215

技能单4　细胞融合技术 215

第六节　杂交瘤的培养及观察 217

资料单 217

杂交瘤细胞的选择性培养 217

技能单　杂交瘤的培养观察 220

第七节　单克隆抗体的筛选与检测 221

资料单 221

一、概述 221

二、ELISA原理 222

三、ELISA间接法 223

技能单1　ELISA试剂的配制 223

技能单2　ELISA间接法筛选杂交瘤阳性孔法 225

资料单 227

一、杂交瘤克隆化概述 227

第八节 杂交瘤的克隆化及冻存与复苏 227

二、杂交瘤克隆化方法 228

三、杂交瘤细胞的冻存与复苏 230

技能单1　克隆化技术1——有限稀释法 231

技能单2　克隆化技术2——软琼脂法 233

技能单3　克隆化技术3——单细胞显微操作法 234

第九节 单克隆抗体的大量制备及影响因素和失败原因分析 235

资料单 235

一、单克隆抗体的制备 235

二、单克隆抗体的鉴定 236

三、McAb的影响因素和失败原因分析 237

技能单1　腹水制备单克隆抗体法 238

技能单2　ELISA间接法检测腹水中抗体滴度 241

资料单 243

一、卵泡的发育及其形态特点 243

第一节　卵细胞 243

第七章　卵细胞及胚胎干细胞培养技术 243

二、卵子 245

三、卵母细胞的采集和成熟培养 247

四、受精卵（胚胎）的早期发育 251

五、早期胚胎的体外培养 253

技能单1　冲卵液的配制 255

技能单2　屠宰家畜卵巢卵母细胞的采集 256

技能单3　活体卵巢卵母细胞的采集 257

技能单4　猪卵母细胞的体外成熟培养 258

技能单5　小鼠的胚胎回收与检胚 260

第二节　胚胎干细胞培养 261

资料单 261

一、早期胚胎来源的ES细胞分离克隆程序 261

二、胚胎干细胞培养及要求 262

三、影响胚胎干细胞分离克隆的因素 263

技能单　胚胎干细胞的培养 267

参考文献 269