蛋白质与蛋白质组学实验指南PDF电子书下载

第1章 蛋白质组学导论 1

1.1　蛋白质组学定义 3

1.2　为何除基因组学外还要有蛋白质组学？ 5

1.3　蛋白质的鉴定和分析 10

1.4　差异显示蛋白质组学（比较蛋白质组学） 17

1.5　翻译后修饰 19

1.6　蛋白质微阵列 23

1.7　捕获分子和靶分子 24

参考文献 26

网络资源 33

第2章 单向聚丙烯酰胺凝胶电泳 35

2.1　聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 38

2.2　SDS用于变性的聚丙烯酰胺凝胶 42

2.5　非变性PAGE（自然凝胶电泳）分离天然蛋白和蛋白复合体 45

2.4　三羟甲基甘氨酸SDS-PAGE分离小分子多肽 45

2.3　乙酸－尿素PAGE根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质 45

实验方案 47

方案1　蛋白质的SDS-PAGE 47

替代方案：用Bio-Rad 385 Gradient Former灌制线性梯度凝胶 52

方案2～7的导言：蛋白质显色步骤 56

方案2　传统的考马斯亮蓝染色 58

方案3　快速考马斯亮蓝染色 60

方案4　InstaStain Blue凝胶纸染色 62

方案5　SYPRO Ruby荧光染色 64

方案6　SYPRO Orange荧光染色 66

方案7　与质谱兼容的银染 68

方案8　表观分子量的判定 70

方案9　CTAB-PAGE 72

方案10　酸－尿素连续PAGE 74

方案11　肽类的电泳（Tricine-SDS-PAGE） 76

方案12　蛋白质的非变性PAGE 78

参考文献 80

网络资源 82

第3章 细胞和亚细胞提取物的制备 83

3.1　通过机械或化学方法破碎组织及细胞 85

3.2　通过变性和复性从包含体中回收重组蛋白 88

3.3　富含目的蛋白的亚细胞提取物的制备 90

实验方案 93

方案1　哺乳动物组织的匀浆 93

附加方案：从组织匀浆液中去除黏蛋白 97

方案2　用于免疫沉淀的培养细胞的裂解 98

方案3　用于免疫印迹的动物培养细胞、酵母和细菌的裂解 100

方案4　氮舱减压法裂解培养细胞 102

方案5　细菌中重组蛋白的小量提取 106

方案6　细菌中重组蛋白的大量提取 108

方案7　从包含体中溶解大肠杆菌重组蛋白 110

方案8　酵母提取物的制备 112

方案9　真核细胞结构组分的差异去垢剂分离法 114

附加方案：去垢剂提取物中RNA的分离 123

附加方案：用镁沉淀微管蛋白和微管结合蛋白 124

参考文献 126

选读文献 130

网络资源 130

第4章 固相化pH梯度双向凝胶电泳 131

4.1　双向凝胶电泳样品的制备 134

4.2　第一向：固相pH梯度等电聚焦电泳 138

4.3　第二向：根据分子量分离蛋白质 139

4.4　双向凝胶的染色 141

4.5　双向凝胶中蛋白质的转移 144

4.6　双向凝胶图像的获取和分析 145

方案1　双向凝胶电泳鼠肝蛋白质提取物的制备 149

实验方案 149

方案2　双向凝胶电泳真核生物细胞裂解物的制备 151

附加方案：用放射性同位素标记真核生物细胞蛋白质 152

方案3　双向凝胶电泳大肠杆菌裂解液的制备 154

方案4　双向凝胶电泳脑脊液蛋白样品的制备 156

方案5　第一向：蛋白质的等电聚焦电泳 158

方案6　垂直SDS平板凝胶的制备：均一凝胶的灌制 162

方案7　垂直SDS平板凝胶制备：同时灌制多梯度凝胶 165

方案8　IPG胶条的平衡 169

方案9　第二向：蛋白质的SDS-PAGE 171

方案10　胶体考马斯亮蓝染色 174

方案11　银氨染色 176

方案12　与质谱兼容的银染法 180

方案13 用SYPRO Ruby进行荧光染色 183

方案14　用GelCode磷蛋白染色试剂盒对磷蛋白进行染色 185

方案15　双向凝胶的槽式转移 187

方案16　双向凝胶的半干印迹 190

方案17～20的导言：膜上蛋白质的染色 192

方案17　用丽春红S染色膜上的蛋白质 193

方案18　用考马斯亮蓝R250染色膜上的蛋白质 194

方案19　用印度墨水染色膜上的蛋白质 195

方案20　用胶体金染色膜上的蛋白质 196

网络上有关双向电泳的信息资源 197

参考文献 200

第5章　反相高效液相色谱 203

5.1　RP-HPLC基于疏水相互作用分离分子 204

5.2　RP-HPLC标准色谱条件 205

5.3　微柱反相色谱——适合蛋白质组学的研究方法 213

实验方案 219

方案1　蛋白质RP-HPLC的标准色谱条件 219

方案2　填充RP-HPLC毛细管微柱 224

方案3　不易分离的大分子量多肽的纯化 231

方案4　用RP-HPLC对固相合成的多肽进行纯化 238

方案5　用RP-HPLC技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐 244

方案6　计算机辅助方法优化梯度条件的RP-HPLC蛋白质分离 248

参考文献 258

选读文献 263

网络资源 263

第6章 蛋白质氨基端及羧基端序列分析 265

6.1　Edman降解法对多肽进行氨基端测序 267

6.2　限制序列分析速度的几个环节 275

6.3　应用HPLC和PAGE制备微量测序样品 279

6.4　不能进行测序的蛋白质需去封闭 282

6.5　磷酸化位点的微量测序分析有助于绘制信号途径 283

6.6　固相测序仪是回收磷酸化氨基酸的最好方法 283

6.8　羧基端测序方法存在的问题 284

6.7　其他氨基端反应法 284

6.9　自动化羧基端测序 285

6.10　高灵敏度高效率的羧基端分析 285

6.11　氨基端和羧基端序列组合分析 289

实验方案 291

方案1　两相柱测序仪的样品上样 291

方案2　将蛋白质从凝胶电转移至PVDF膜 293

方案3　检测PVDF膜上的蛋白质 297

方案4　浓缩聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质点 299

方案5　磷酸化多肽的固相微量测序 302

方案6　羧基端序列分析 304

单位换算指南 307

参考文献 309

选读文献 312

网络资源 313

第7章 电泳分离的蛋白质肽谱和序列分析 315

7.1　制备肽谱的微量方法和大规模方法 318

7.2　消除蛋白质分子内部的共价交联以提高肽谱质量 319

7.3　酶法和化学法裂解多肽链 323

7.4　基于SDS-PAGE的肽谱制备方法（Cleveland法） 333

7.5　肽谱用于确定蛋白质中的二硫键 334

7.6　应用RP-HPLC制备肽谱 335

实验方案 339

方案1　蛋白质的过甲酸氧化 339

方案2　蛋白质还原和S－羧甲基化：大规模方法 341

方案3　蛋白质还原和S－羧甲基化：微量方法 344

方案4　用Ellman试剂测定自由巯基和二硫键 347

方案5　蛋白质的胰酶消化 349

附加方案：用琥珀酸酐修饰赖氨酰侧链 351

附加方案：用柠檬酸酐修饰赖氨酰侧链 352

方案6　用溴化氰切割Met-X键 353

方案7　用羟胺切割Asn-Gly键 355

方案8　邻亚碘酰苯甲酸在色氨酸处切割 357

方案9　胶内蛋白质的考马斯亮蓝染色 359

方案10　胶内蛋白质的锌／咪唑负染色 361

方案11　胶内蛋白质的硝酸银染色 363

方案12　胶内蛋白质的S－吡啶乙基化 365

方案13　胶内蛋白质的酶解和肽段提取 367

方案14　电印迹膜上的蛋白质消化 369

方案15　标准条件下肽段的反相HPLC 372

方案16　SDS-PAGE肽谱作图方法（Cleveland法） 378

方案17　原位SDS-PAGE肽谱作图方法（Cleveland法） 380

蛋白酶和肽酶命名法 383

参考文献 384

选读文献 390

网络资源 390

第8章　质谱在蛋白质组学中的应用 391

8.1　基本原理 393

8.2　现代离子化方法：离子如何形成 400

8.3　串联质谱仪 405

8.4　串联质谱仪的质量分析器结构 407

8.5　质谱与蛋白质分离方法联用进行蛋白质混合物的分离和分析 412

8.6　体内及体外标记方法：质谱用于定量和表达蛋白质组学 426

8.7　利用MS数据鉴定蛋白质的搜索引擎 427

8.8　总结 436

实验方案 437

方案1　蛋白质和多肽MALDI-MS分析的一般方法 437

方案2　反相微型层析柱的制备 441

方案3　固定化酶微型层析柱的制备 444

方案4　用于蛋白质组分析的微毛细管HPLC色谱及ESI一体化装置的制备和使用 446

方案5　利用Nano-LC耦联MS/MS分析复杂蛋白质混合物 455

方案6　利用多维蛋白质鉴定技术分析复杂蛋白质混合物 466

附加方案：用于MuDPIT分析的不溶性蛋白样品的消化 470

方案7　二维色谱和质谱结合分离多肽混合物：离线方法 472

方案8　通过肽的半胱氨酰化捕获蛋白质 477

方案9　蛋白质的同位素亲和标签 480

方案10　定量蛋白质组学的体内蛋白质同位素标记 488

方案11　利用脱水胰酶亲和捕获蛋白质 494

方案12　应用分子扫描器进行蛋白质组分析 498

方案13　利用化学印刷法进行肽质量指纹图谱分析 508

利用MS/MS进行“自上而下”的蛋白质序列分析 517

气相质子化肽段的裂解机理 525

参考文献 532

网络资源 542

第9章 用蛋白质组学方法绘制磷酸化位点图谱 543

9.1　完整磷酸化蛋白的检测和分析 547

9.2　通过蛋白质的裂解获得磷酸化蛋白多肽 549

9.3　用MS或MS/MS来确定磷酸化蛋白的特性 549

9.5　对磷酸化蛋白特征进行分析的多维策略 563

9.4　用MS/MS对磷酸化多肽进行测序 563

9.6　用于磷酸化多肽序列分析的MS和MS/MS技术的出现 564

9.7总结 565

实验方案 566

方案1　用带有Fe（Ⅲ）和Ga（Ⅲ）的IMAC纯化磷酸化多肽 566

附加方案：用于样品去盐的微柱和Nanoscale IMAC的制备和使用 569

方案2　在MALDI分析之前或之后对磷酸化多肽进行碱性磷酸酶处理 570

方案3　结合固定化金属离子亲和介质和MALDI-TOF-MS直接分析方法对磷酸化多肽进行特征分析 573

方案4　离线micro-IMAC富集磷酸化蛋白 579

方案5　用μLC-ESI-MS/MS对磷酸化多肽进行分析 582

方案6　MALDI-MS确定酪氨酸磷酸化位点 584

方案7　用ESI-MS确定丝氨酸、苏氨酸的磷酸化位点 590

附加方案：用放射性磷酸盐确定自发磷酸化位点 594

方案8　用ESI-MS确定组氨酸磷酸化位点 596

参考文献 599

网络资源 605

第10章 蛋白质复合体性质的研究 607

10.1　mRNA的选择性剪接对蛋白质产物活性的特定影响 609

10.2　用相互作用组描述生理复合体 609

10.3　利用酵母双杂交分析与蛋白质组学方法研究蛋白质间相互作用 611

10.4　用亲和捕获技术分析蛋白质相互作用 612

10.5　了解多蛋白质复合体的结构 618

10.6　FRET分析体内蛋白质相互作用 623

10.7　通过测定结合常数来分析蛋白质间相互作用 626

10.8　蛋白质微阵列促进大规模的蛋白质研究 627

实验方案 634

方案1　用FLAG抗原表位标记蛋白质进行蛋白质免疫共沉淀 634

方案2　细胞裂解液中相互作用蛋白的亲和纯化 640

方案3　多蛋白质复合体的非变性琼脂糖凝胶电泳 645

方案4　BN-PAGE蛋白质分析法 649

方案5　采用交联法和质谱法对蛋白质复合体进行拓扑学分析 657

方案6　亚秒级光交联：用水溶性金属复合体监控蛋白质－蛋白质相互作用 665

方案7　位点特异性蛋白质－DNA光交联法：分析蛋白质－DNA和多蛋白质－DNA复合体的结构组成 671

方案8　用FRET法分析体内蛋白质的相互作用 685

方案9　用GFP嵌合体监控蛋白质－蛋白质相互作用 694

方案10　蛋白质阵列：显微镜玻片的制备 699

方案11　蛋白质阵列：标记蛋白并通过阵列检测来研究蛋白质蛋白质相互作用 702

附加方案：如何防止产生拖尾 705

方案12　蛋白质阵列：标记复合体并通过阵列检测来研究蛋白质－小分子相互作用 706

方案13　蛋白质阵列：阵列的探针标记方法及激酶－底物相互作用的放射性印迹检测 709

方案14　蛋白质阵列：用“三明治法”研究复合体溶液 711

参考文献 714

网络资源 721

第11章 蛋白质组学实验结果的诠释：利用生物信息学发现蛋白质的结构、功能 723

及其相互作用 723

11.1　基因及其同源体的识别 725

方案1　利用Gapped-BLAST对一条长肽段进行简单序列查找 727

方案2　用双向最佳匹配法快速识别直源体 734

11.2　预测蛋白质的结构和功能 736

11.3　蛋白质在通路中的定位和蛋白质细胞功能的识别 743

方案3　用基因融合假说寻找功能相关联的蛋白质——基于结构域的搜索 746

方案4　操纵子的快速识别 748

方案5　通过系统发育谱的比较发现功能相关联的蛋白质 750

方案6　从DNA微阵列数据中发现功能相关联的蛋白质 755

参考文献 759

网络资源 762

附录1　参考图表 765

附录2　技术 773

附录3　注意事项 822

附录4　供应商 836

索引 837