转录因子实用技术 第2版PDF电子书下载

目录 1

1 DNA迁移率变动分析 1

1.1 概述 1

1.2 DNA结合蛋白的检测 2

1.2.1 DNA迁移率变动分析的应用 2

1.2.2 DNA探针的选择 5

1.2.3 用于阻滞分析的标记寡聚核苷酸探针的制备 6

1.2.4 限制性片段探针的标记 7

1.2.5 蛋白提取物的制备 9

1.2.6 结合反应 11

1.2.7 少量提取物的制备 13

1.3 用于结合分析的蛋白质的其他来源 13

1.3.1 在细菌中表达DNA结合蛋白 14

1.3.2 用哺乳动物细胞表达蛋白 15

1.3.3 体外转录和翻译——体外表达 15

1.3.4 用杆状病毒系统表达转录因子 16

1.3.5 转录因子蛋白的纯化 16

1.4 DNA结合特性的分析 16

1.5 DNA结合蛋白的特性 18

1.5.1 抗体的添加 18

1.5.2 潜在配基的添加 19

1.5.3 酶解剪除后的带变动分析 20

1.6 蛋白-蛋白相互作用的分析 21

1.7 结论 22

2 DNA-蛋白质复合体体外和体内足迹分析 24

2.1 概述 24

2.2 体外足迹分析 26

2.2.1 以结合位点碱基级分辨率对32P末端标记的片段进行分析 26

2.2.2 在闭合环状质粒上的结合分析 40

2.3 体内足迹分析 44

2.3.1 体内DNA修饰 49

2.3.3 用于LMPCR的接头 52

2.3.2 基因特异性巢式引物 52

2.3.4 LMPCR核苷酸分辨率的可视化 53

3 体外转录和转录因子的特征 61

3.1 概述 61

3.2 体外转录分析 61

3.3 天然转录因子相对分子质量的测定 66

3.3.1 用凝胶过滤色谱测定相对分子质量 67

3.3.2 用甘油梯度离心测定相对分子质量 70

3.3.3 用非变性梯度凝胶电泳测定天然转录因子的分子质量 72

3.4 变性转录因子分子质量的测定 74

3.4.2 与溴脱氧尿苷置换的DNA进行UV交联 75

3.4.1 转录因子与DNA的紫外交联 75

3.4.3 转录因子与未置换探针的紫外交联 78

3.4.4 从SDS-聚丙烯酰胺凝胶复性转录因子 80

3.5 DNA结合型转录因子的单体和二聚体的结构分析 81

3.5.1 通过DNA凝胶阻滞分析解析转录因子 82

3.5.2 通过化学交联分析转录因子亚基 83

3.5.3 与相邻应答元件结合的二聚体之间的协同结合分析 84

3.6 非DNA结合转录因子的鉴定及其初步特征 85

3.6.1 分析DNA结合和非DNA结合转录因子之间的直接结合 86

3.6.2 “超级阻滞”凝胶阻滞分析 87

3.6.3 在非DNA结合转录因子存在和缺乏时转录因子-DNA复合体的解离分析 88

3.6.4 用免疫共沉淀分析转录因子间的直接相互作用 89

4 DNA结合转录因子的纯化及克隆 93

4.1 概述 93

4.2 缓冲液与溶液 94

4.3 核提取物的制备 96

4.4 DNA-纤维素层析 99

4.5 DNA亲和层析 100

4.6 反相层析 107

4.7 多肽的制备与分离 108

4.8 用于分离cDNA的寡核苷酸的设计 113

5.1 概述 119

5 用cDNA表达文库克隆转录因子 119

5.2 噬菌体表达文库的构建 120

5.2.1 文库的选择 120

5.2.2 文库的平板筛选 120

5.2.3 噬菌斑的纯化 122

5.3 筛选方法 122

5.3.1 简介 122

5.3.2 以DNA结合位点为探针的筛选法 123

5.3.3 免疫筛选 129

5.3.4 文库筛选的其他方法及其相对优点 132

5.4 因子的鉴定 133

6.2 克隆转录因子的方法 138

6.2.1 低严紧杂交 138

6 由序列相似性克隆转录因子 138

6.1 简介 138

6.2.2 聚合酶链式反应法 141

6.2.3 In silico法鉴定新的转录因子 151

6.3 由同源性克隆转录因子的一些例子 153

7 采用结合位点克隆技术鉴定转录因子的靶基因 155

7.1 概述 155

7.2 利用核DNA结合位点（GBS）的克隆方法 155

7.2.1 转录因子蛋白的制备 156

7.2.2 DNA的来源 159

7.2.4 GBS克隆程序 160

7.2.3 筛选程序 160

7.2.5 对CpG岛的GBS克隆法 163

7.3 利用由GBS克隆法获得的DNA片段进行靶基因分子克隆 164

7.3.1 同源序列印迹分析 164

7.3.2 RNA印迹分析 164

7.3.3 测序与DNA数据检索 165

7.3.4 核基因片段的结合活性 166

7.3.5 核基因片段的增强子活性 167

7.3.6 用GBS克隆所得DNA片段克隆靶基因 167

7.4 结论 168

8.1 概述 170

8 克隆的转录因子的分析 170

8.2 用缺失和点突变对结构域进行作图与分析 171

8.2.1 用PCR制作缺失突变体 172

8.2.2 点突变 173

8.3 表达系统 175

8.3.1 利用体外翻译系统和过量表达系统分析转录因子功能 175

8.3.2 在细菌中表达 177

8.3.3 在哺乳动物细胞中表达 180

8.3.4 在哺乳动物细胞中过量表达 181

8.3.5 在酵母和昆虫细胞中过量表达 182

8.3.6 表达体系的比较 183

8.4 克隆的因子的特性分析 184

8.4.1 哺乳动物细胞的瞬时转染 184

8.4.2 报道基因和对照质粒 184

8.4.3 转染方法 186

8.4.4 转染细胞中报道基因的活性分析 187

8.4.5 用嵌合蛋白鉴定反式激活结构域 189

8.5 蛋白质与DNA之间相互作用的分析 189

8.5.1 利用凝胶阻滞实验分析DNA结合活性 189

8.6 体外蛋白质之间相互作用的分析 193

8.6.1 用GST钓鱼分析法测定蛋白质之间的相互作用 193

8.6.2 用免疫沉淀法分析蛋白质之间的相互作用 194

8.6.3 用凝胶阻滞实验分析蛋白质之间的相互作用 195

8.6.4 用ABCD法分析蛋白质与蛋白质间的相互作用 197

8.6.5 用双杂交法分析细胞内蛋白质与蛋白质间的相互作用 199

8.7 小结 199

9 利用鼠脑细胞核提取物体外转录分析神经元启动子 201

9.1 概述 201

9.2 背景 201

9.3 应用 202

9.3.1 与转染和转基因鼠研究的比较 202

9.3.2 研究染色质结构对转录的影响 202

9.4.2 鼠脑细胞核提纯 203

9.4.1 简介 203

9.4 细胞核提取物的制备 203

9.4.3 细胞核蛋白质的提取 205

9.5 体外转录 209

9.5.1 体外转录反应概述 209

9.5.2 体外转录的典型结果 210

9.5.3 体外转录的注意事项 211

9.5.4 启动子模板 212

9.6 结束语 212

10.2 利用染色质模板的实验方法 214

10.2.1 染色质结构简介 214

10.1 概述 214

10 用于转录研究的染色质模板的制备 214

10.2.2 在染色质模板上转录的起始和延伸 215

10.2.3 单核小体与多核小体模板 215

10.3 染色质模板的制备 216

10.3.1 技术考虑 216

10.3.2 爪蟾（Xenopus）细胞核提取物 217

10.3.3 果蝇胚胎细胞核提取物 218

10.3.4 微小染色体制备（minichromosome preparation） 218

10.3.5 单核小体制备 219

10.4 组蛋白的制备 220

10.4.1 羟磷灰石（hydroxyapatite）纯化的原理 220

10.5.1 用于重建的DNA片段所应注意的问题 227

10.5 通过盐-尿素透析重建单核小体 227

10.5.2 重建反应中需要的DNA量 230

10.5.3 计算在重建反应中组蛋白的量 231

10.5.4 核小体重建的纯化 233

10.5.5 重建核小体的鉴定 235

10.6 结合核小体模板的转录因子 239

11 转录因子修饰分析 243

11.1 概述 243

11.2 磷酸化 243

11.2.1 凝胶电泳 245

11.2.2 体外去磷酸化 247

11.2.3 放射性标记 251

11.2.4 磷酸化位点作图 253

11.2.5 体外磷酸化 262

11.2.6 磷酸化位点特异性抗体的制备和使用 264

11.2.7 功能分析 264

11.2.8 分析磷酸化蛋白的其他方法 265

11.3 其他转录后的修饰 266

11.3.1 O-连糖基化 266

11.3.2 其他的修饰 271

11.4 结论 271

附录 常用缩略词 275