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第1章 工具酶 1

1.1 限制性核酸内切酶 1

第1篇 基因工程基本技术 1

1.2 其他工具酶 3

第2章 常用载体 7

2.1 质粒载体 7

2.2 噬菌体类载体 9

2.3 酵母菌的克隆与表达载体 10

2.4 细菌人工染色体（BAC） 11

第3章 质粒的制备和鉴定 13

3.1 概述 13

3.2 试剂 14

3.4 注意事项 15

3.3 操作步骤 15

第4章 PCR技术 17

4.1 PCR原理 17

4.2 PCR实验过程 17

4.3 影响PCR效果的因素 19

4.4 常用的PCR技术 20

第5章 核酸探针制备 23

5.1 放射性标记DNA探针与RNA探针的制备 23

5.2 非放射性同位素标记探针 26

第6章 核酸分子杂交技术 29

6.1 核酸杂交的类型与选用 29

6.2 核酸探针的种类 29

6.3 Southern印迹杂交 30

6.4 Northern印迹杂交 33

6.5 Western印迹杂交 34

6.6 斑点杂交 37

6.7 菌落原位杂交 37

6.8 组织原位杂交 38

6.9 影响固相杂交效果的因素 39

6.10 液相杂交的简介 40

第7章 核酸序列分析 42

7.1 Sanger双脱氧链终止法 42

7.2 化学法 44

7.3 DNA序列分析的自动化 45

7.4 委托测序 46

8.1 体内随机基因诱变 50

第8章 基因突变 50

8.2 体内特定基因突变 54

8.3 体外基因定点突变 58

参考文献 60

第2篇 cDNA文库和基因组DNA文库的构建 62

第9章 RNA的制备 62

9.1 总RNA的提取制备 62

9.2 mRNA的提取制备 66

9.3 RNA操作的关键要点 69

第10章 cDNA文库的构建 70

10.1 原理及主要流程 70

10.2 构建cDNA文库的一些方法 71

第11章 海洋生物基因组DNA的制备 88

11.1 方法一 88

11.2 方法二 89

第12章 真核生物基因组文库的构建 91

12.1 试剂盒已含有的试剂 91

12.2 自备的样品、试剂、耗材和设备 92

12.3 操作步骤 92

第13章 目的基因的筛选 95

13.1 核酸探针筛选法 95

13.2 免疫探针筛选法 96

13.3 功能筛选法 96

13.4 文库筛选基本操作步骤 96

第3篇 基因表达技术 100

第14章 原核生物表达系统 100

14.1 外源基因在原核生物中表达的特点 100

14.3 外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件 101

14.2 外源基因在原核细胞中表达的一般策略 101

14.4 外源基因在原核细胞中的表达形式 106

14.5 利用原核细胞表达外源基因的实验操作 107

第15章 杆状病毒表达载体系统 121

15.1 杆状病毒表达系统的特点 121

15.2 构建重组杆状病毒的一般策略 122

15.3 利用杆状病毒在昆虫细胞中表达外源基因的操作步骤 128

第16章 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 136

16.1 哺乳动物细胞表达载体 136

16.2 外源DNA导入哺乳动物细胞的方法 140

16.3 外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达 145

16.4 外源基因在哺乳动物细胞系中的稳定表达 146

16.5 病毒介导的基因表达 148

17.1 酿酒酵母表达系统 150

第17章 酵母表达系统 150

17.2 巴斯德毕赤酵母表达系统 153

参考文献 168

第4篇 分子标记的种类及其实验方法 170

第18章 分子标记的种类 171

18.1 传统的Southern杂交为基础的分子标记 171

18.2 PCR为基础的分子标记 171

18.3 重复序列为基础的分子标记 171

18.4 mRNA为基础的分子标记 171

第19章 常用分子标记及其原理 172

19.1 基于Southern印迹杂交技术的常用分子标记－RFLP 172

19.2 基于PCR的常用分子标记－RAPD 173

19.4 以重复序列为基础的标记－微卫星DNA标记 174

19.3 RFLP与PCR结合的分子标记－AFLP 174

第20章 分子标记实验操作技术 176

20.1 RFLP实验操作技术 176

20.2 RAPD实验操作技术 176

20.3 AFLP实验操作技术 177

20.4 微卫星DNA实验操作技术 179

参考文献 180

第5篇 DNA－蛋白质相互作用 181

第21章 研究DNA－蛋白质相互作用的方法 182

21.1 DNA结合蛋白的凝胶阻滞（或迁移率）试验 182

第22章 特异性DNA结合蛋白的纯化技术 191

22.1 概述 191

22.2 亲和层析柱纯化特异性DNA结合蛋白 192

22.3 改进的亲和纯化技术 196

23.1 基本原理 204

第23章 DNA结合蛋白特异结合位点的确定 204

23.2 利用表达文库筛选和鉴定编码DNA结合蛋白的cDNA 206

参考文献 209

第6篇 蛋白质与蛋白质的相互作用 211

第24章 噬菌体展示系统 214

24.1 概述 214

24.2 实验方案 217

第25章 酵母双杂交系统 221

25.1 概述 221

25.2 实验方案 228

26.1 概述 242

第26章 印迹重叠实验 242

26.2 实验方案 244

26.3 用抗GST抗体来测定蛋白质－蛋白质结合的实验方案 246

第27章 GST融合蛋白下拉技术 247

27.1 概述 247

27.2 实验方案 249

第28章 免疫沉淀方法研究蛋白质的相互作用 251

28.1 概述 251

28.2 实验方案 253

第29章 串联亲和纯化技术 255

29.1 概述 255

29.2 实验方案 257

30.1 实验概述 261

第30章 用质谱法研究蛋白质的相互作用 261

30.2 实验方案 267

第31章 荧光共振能量转移用于蛋白质之间的相互作用 269

31.1 概述 269

31.2 实验方案 272

第32章 表面等离子体共振生物传感器测定蛋白质之间的相互作用 280

32.1 概述 280

32.2 实验方案 284

参考文献 286

第7篇 海洋生物功能相关基因的筛选和鉴定 294

第33章 mRNA差异显示技术 294

33.1 基本原理 294

33.2 GenomyxLRS荧光差异显示系统 295

33.3 实验方法 296

第34章 抑制性差减cDNA(SSH)克隆技术 300

34.1 抑制性差异显示技术原理 300

34.2 抑制性差减杂交的比较优势 302

34.3 SSH的操作步骤 303

第35章 蛋白质微阵列（芯片） 308

35.1 概述 308

35.2 蛋白质微阵列（芯片）的制作 309

35.3 蛋白质的标记、在芯片上杂交及杂交信号的检测与分析 317

35.4 蛋白质芯片的应用 321

第36章 蛋白质组学 324

36.1 概述 324

36.2 双向电泳 326

36.3 质谱 330

37.1 基本原理 334

第37章 DNA微阵列技术 334

37.2 操作流程 335

参考文献 342

第8篇 海洋微生物基因工程技术 347

第38章 海洋微生物样品的采集和保存 347

第39章 确定样品中细菌数量和种类的方法 349

39.1 样品中细菌的染色计数方法 349

39.2 荧光原位杂交技术 350

39.3 核糖体小亚基SSU-DNA序列的扩增比较和分析建立系统发育进化树 351

第40章 海洋环境样品中特异基因转录和表达的分析 356

40.1 从样品中直接提取RNA的不同方法 356

41.1 从海洋中筛选几丁质降解菌以及几丁质酶的初步分析 358

第41章 海洋微生物的产酶分析 358

41.2 其他常见酶类产生菌的筛选方法 360

第42章 海洋极端微生物的培养 362

42.1 嗜耐冷（低温）微生物的培养 362

42.2 从低温环境样品中分离低温微生物 363

42.3 嗜高压微生物的培养 364

42.4 深海嗜热微生物的培养 365

参考文献 368

第9篇 藻类基因工程 369

第43章 蓝藻基因工程 369

43.1 蓝藻DNA的提取 370

43.2 蓝藻基因克隆载体的设计和构建 371

43.3 克隆载体转化蓝藻 377

43.4 提高外源基因在蓝藻细胞中表达量的策略 382

44.1 衣藻叶绿体DNA的提取 384

第44章 衣藻基因工程 384

44.2 衣藻叶绿体转化系统 385

44.3 衣藻核遗传转化系统 388

44.4 衣藻遗传转化方法 390

44.5 筛选衣藻转化子的策略 392

第45章 小球藻基因工程 394

45.1 构建克隆载体的策略 394

45.2 转化方法 394

第46章 裸藻基因工程 396

46.1 裸藻的转化载体 396

46.2 基因枪转化和转化子筛选 397

第47章 大型藻基因工程 398

47.1 龙须菜遗传转化 398

47.2 海带的遗传转化 399

第48章 部分藻类常用培养基 400

48.1 蓝藻培养基 400

48.2 衣藻培养基 400

参考文献 403

第10篇 生物软件与生物信息数据库 405

第49章 分子生物学软件入门 405

49.1 OMIGA2.0 405

49.2 DNAMAN 5.0 414

第50章 生物信息数据库 430

50.1 NCBI的Entrez服务 430

50.2 BLAST和FASTA 433

参考文献 434

附录 435

索引 449