小鼠发育生物学与胚胎实验方法PDF电子书下载

五、灭活仙台病毒的制作 34 1

第一节　小鼠发育生物学研究的意义 3

目录 3

第一篇 发育生物学与小鼠的发育 3

第一章　发育生物学研究与发育的基本规律 3

二、小鼠发育遗传学的根源 4

第二节　小鼠发育遗传学的研究历史 4

一、小鼠遗传学研究的初始阶段 4

一、实验性小鼠胚胎学的起源 6

第三节　实验性小鼠胚胎学的研究 6

二、小鼠发育的基因调控研究历史 7

三、小鼠新基因及发育性变异的系统性研究 8

一、发育生物学需解决的问题 10

第四节　发育生物学的基本问题与概念 10

二、发育生物学的基本概念 12

一、早期发育的基本过程 26

第五节　小鼠胚胎发育的基本过程 26

二、小鼠胚胎发育的基本过程 27

二、生物发育始于受精 29

第六节　胚胎期发育的基本规律 29

一、卵细胞具有极性 29

四、原肠期与胚层形成 30

三、卵裂是一系列迅速的细胞分裂 30

五、组织细胞分化和器官形成 31

第二章　小鼠的早期胚胎发育概况 33

一、生殖细胞的起源以及向生殖嵴的移动 37

第一节　生殖细胞的起源、移动及性别确定 37

二、性别确定与生殖细胞 38

一、精子生成 39

第二节　精子、卵子的发生 39

三、卵子和精子发生的比较 41

二、卵子发生 41

一、排卵 42

第三节　排卵、受精和卵细胞骨架的组建 42

二、受精 43

三、受精前后卵细胞的细胞骨架组建 45

二、早期卵裂中的蛋白表达 46

第四节　早期卵裂与胚泡形成 46

一、卵裂胚胎的特征 46

三、细胞的聚集和极化 47

五、胚胎核发育潜能的限制 48

四、细胞聚集与粘连中的变化 48

一、植入 49

第五节　植入与胚层的形成和分化 49

二、原肠胚形成开始与滋养外胚层的衍化 50

三、原始外胚层的形成 51

四、原肠胚形成以及中胚层和内胚层的形成 53

五、结节的形成 55

一、胚外内胚层 57

六、中胚层组织多样化的产生 57

第六节　胚外组织的形成 57

二、内脏内胚层中的基因表达 58

四、胚外中胚层的分化 59

三、壁内胚层中的基因表达 59

五、胎盘的结构和功能 60

一、印刻作用 61

第七节　发育中的印刻作用 61

二、X-灭活 62

三、单性生殖 63

一、模式系统 64

第三章　模式系统及躯体计划模式 64

第一节　模式系统与模式生物 64

二、模式生物：脊椎动物 65

三、小鼠是研究人类发育的模式生物 66

一、脊椎动物体轴和胚层 68

第二节　躯体计划模式与体节的作用 68

三、体节形成和模式化 70

二、原肠胚期躯体的计划模式 70

一、小鼠早期胚胎细胞的命运 74

第三节　早期胚胎细胞命运决定的模式机制 74

三、诱导中胚层的信号 75

二、来自植物区域的信号诱导中胚层 75

一、前内脏内胚层的模式及细胞运动 76

四、中胚层特异基因表达的时间和调控 76

第四节　前内脏内胚层及其对胚胎模式的影响 76

二、脊椎动物前部发育的基本要素 77

三、前内脏内胚层影响胚胎前部模式 78

一、原条与组织区 79

第五节　原条和组织区的作用与神经诱导 79

二、组织区的作用 81

三、组织区与神经诱导 84

一、脊椎动物体轴的特化 85

第六节　哺乳动物的体轴发育 85

二、脊椎动物体轴的早期确定 86

三、影响小鼠胚胎体轴模式的因素 88

一、左右轴的形成与不对称性 91

第七节　体轴发育的早期不对称性 91

三、脊椎动物的器官左右位置是由遗传控制的 92

二、内部器官的左右特异性 92

四、左右模式的演化 94

五、Nodal与Lefties的不对称表达 95

一、细胞分化与发育 97

第四章　细胞分化、形态发生与器官形成 97

第一节　细胞分化 97

二、基因表达模式的可逆性和遗传性 98

三、细胞分化中特定基因的表达及调控 100

一、肌细胞分化模型 102

四、细胞分化与程序性细胞死亡 102

第二节　细胞分化模型 102

二、血细胞分化模型 104

一、形态发生的内容 105

第三节　胚胎的早期形态发生 105

二、细胞的社会性 106

四、细胞粘附 107

三、细胞识别 107

五、细胞连接 108

六、细胞迁移 110

七、细胞与细胞外基质的相互作用 112

八、芽的形态发生模式 113

一、尾芽与体节及其衍生物 115

第四节　器官发生 115

二、肢体发育是典型的器官发育模式 119

四、肠的发生 120

三、肾发生中的诱导模式 120

五、芽的形态发生与肺的发育 121

二、细胞增殖、细胞周期调控与生长发育 123

第五章　胚胎生长发育调控和胚胎后发育 123

第一节　细胞增殖与生长发育 123

一、生长的形式 123

第二节　程序性细胞死亡及其在发育中的作用 125

一、胚胎发育中PCD的作用 126

二、PCD的调控及细胞因子的影响 127

三、小鼠的凋亡相关基因敲除实验 129

第三节　机体发育大小的调控 130

四、PCD进化和起源 130

一、机体发育大小受到综合因素的控制 131

二、细胞生长控制发育大小 132

三、细胞增殖的停止控制机体发育大小 133

四、细胞死亡控制机体发育的大小 135

五、细胞数量的调整与总细胞质量的正常 136

一、发生在生长板上的长骨的生长 137

第四节 发育器官有其内在的生长程序 137

三、成年哺乳动物皮肤和肠上皮不断被干细胞的增殖所代替 138

二、脊椎动物横纹肌的生长依靠拉力 138

一、衰老的机制 139

第五节　生长、衰老和生物进化 139

二、衰老与遗传 142

三、生物发育与进化 143

一、神经系统的基本形成过程 145

第六章　神经系统的发育 145

第一节　神经系统的发生 145

二、脊椎动物神经系统由神经板衍化而来 147

三、早期脑和神经管区域性差异的产生 148

一、旁侧抑制限定神经前体细胞的发生 149

第二节 神经系统中细胞特异性的形成 149

二、脊髓分化依赖于背腹侧信号 150

三、神经元来自细胞的非对称分裂 152

一、神经元细胞骨架的组成成分 153

第三节 神经系统发生中的细胞骨架 153

二、神经细胞骨架的发生过程 154

一、神经管背腹化模式的调控 155

第四节　神经系统形成中的基因调控 155

二、神经营养因子及信号转导 158

第五节　突触的形成和伸长 160

一、神经肌接头的突触形成期 161

二、神经肌接头之间的细胞联系 162

三、生长锥 164

四、轴突的诱导及生长锥引导分子 166

一、 Schwann细胞的发育 168

第六节 Schwann细胞及其前体细胞在神经发育中的调控作用 168

二、Schwann细胞及其前体对神经发育的调节 169

三、Schwann细胞对自身存活的调节 171

一、脊椎动物的四肢由肢芽发育形成 172

第七章 四肢、骨骼、肌肉与血管的发育 172

第一节　脊椎动物四肢发育 172

三、肢体在三个轴向的发育模式 173

二、四肢的发生与位置信息相关 173

四、同源盒基因与肢体发生模式相关并决定肢体的位置 176

第二节　骨组织的发育 177

五、肢体的肌肉、软骨、肌腱的发育 177

二、凝集区与骨骼发育 178

一、骨的发生与模式形成 178

三、BMPs对骨骼发育的调控 179

四、基质金属蛋白酶在骨发生中的作用 180

五、骨形成的方式 181

六、骨组织中细胞的起源与分化 184

七、骨基质的矿化 186

第三节 肌肉的发育 188

二、碱性螺旋基因家族的转录因子 189

一、MyoD家族的肌特异性转录因子 189

三、生长因子在肌发生过程中的调控作用 190

四、肌肉的发生 193

一、血管的发生和毛细血管的形成 195

第四节 血管的发生 195

二、大血管的形成 196

四、胚胎循环 197

三、血管平滑肌的分化和表型变化 197

一、鳃弓和咽区的形成 198

第八章 颅颌面部与口腔的发育 198

第一节 头颅面部的发育 198

二、面部发育过程 200

一、神经嵴细胞的形成、迁移和分化 202

第二节 神经嵴细胞与外胚间充质细胞的发育 202

二、神经嵴细胞分化迁移的影响因素 205

三、颅神经嵴与口腔颌面部的发育 207

四、信号分子对颅神经嵴来源的外胚间充质的基因调控 209

一、腭的发育 211

第三节 腭的发育及腭裂的形成机制 211

二、腭裂形成 213

三、生长因子、致畸原受体与腭裂形成的关系 215

第四节 早期牙胚发生 216

一、牙胚发育的起始和特化 217

二、早期牙胚发育中的上皮-间充质的信号传递途径 218

三、影响牙齿发育的因素 223

四、牙齿发育中的细胞凋亡 226

五、牙齿发育中的神经生长因子和神经支配 227

二、胚胎干细胞与多能干细胞的来源 231

第九章 干细胞 231

第一节 关于干细胞与胚胎干细胞 231

一、干细胞研究历史及现状 231

四、干细胞的生物学行为 232

三、成体干细胞和肿瘤干细胞 232

五、干细胞的诱导分化 234

第二节 几种重要的干细胞 235

六、小鼠胚胎干细胞的研究意义 235

一、神经干细胞和神经嵴干细胞 236

二、骨骼肌干细胞 238

五、骨髓基质干细胞和间质干细胞 242

三、肝脏干细胞 242

四、造血干细胞 242

六、胰腺干细胞 243

七、角膜干细胞 244

一、实验小鼠的起源 247

第二篇 小鼠胚胎实验方法 247

第一章　实验用小鼠的起源和生物学特性 247

第一节 实验小鼠的起源 247

二、近交系的起源及小鼠遗传学特征 248

二、小鼠在发育生物学研究中的价值 248

四、常用近交系小鼠品系特征 252

五、用于遗传性疾病研究的小鼠动物模型 255

一、鼠皮毛的颜色和遗传学 256

第二节 鼠皮毛颜色、色素突变与遗传学 256

二、ABCD色小鼠 257

三、点突变小鼠 258

一、小鼠解剖生理学特点 260

四、其它突变小鼠 260

第三节 小鼠的生物学特征和主要品系 260

二、生物学行为特点 263

三、小鼠的主要品种和品系 264

一、小鼠生殖系统解剖学特点 266

第四节 小鼠的生殖特性 266

二、小鼠排卵和性周期特点 267

三、受精与繁殖 271

一、饲养和管理 272

第五节 小鼠的饲养与常规实验操作 272

二、体温与水的调节 273

三、血液的采集和静脉注射 274

四、麻醉和镇痛 275

一、环境因素 277

第六节 影响小鼠动物试验的因素 277

三、应激 280

二、饮水与食物 280

五、小鼠的非传染性疾病 281

四、动物行为 281

第七节 小鼠胚胎实验中的有关概念 283

一、建立小鼠正常交配、诱导超排卵 288

第二章 小鼠的体外受精及胚胎移植的实验操作 288

第一节 小鼠精、卵细胞获取及体外受精 288

二、卵母细胞与精子的体外分离及体外受精 290

三、单性生殖卵母细胞的活化 292

四、小鼠卵母细胞显微受精方法 293

第二节 假孕雌鼠的胚胎移植 294

一、胚胎的输卵管移植 295

二、胚胎的子宫转移 298

三、剖宫产及小鼠的哺育 299

二、基因转移方法 300

第三章 基因转移技术、转基因小鼠与基因敲除 300

第一节 基因转移方法与转基因动物 300

一、转基因技术的发展 300

一、转基因小鼠作为人类疾病的动物模型 302

第二节　转基因小鼠的应用 302

二、转基因小鼠作为基因治疗的模型 303

三、转基因小鼠用于免疫学研究 304

六、利用启动子指导的基因表达消除特异的细胞谱系 305

四、转基因小鼠用于肿瘤学研究 305

五、转基因小鼠在发育遗传学上的应用 305

一、转移基因的设计 306

第三节　DNA重组基因转移技术 306

二、DNA显微注射系统 308

三、原核的DNA显微注射 313

一、建立提供DNA注射所用受精卵的雌鼠系 319

第四节 转基因和突变鼠系的建立 319

二、建立提供胚胎干细胞注入囊胚的雌鼠系 321

三、转基因实验中的各种鼠系 322

二、基因敲除小鼠的制备 325

第五节 基因敲除小鼠 325

一、概述 325

三、直接型与诱导型基因敲除 326

四、基因敲除的主要应用领域 327

五、问题和展望 329

一、分离卵裂期胚胎细胞、产生聚合嵌合体 330

第四章　嵌合体小鼠与核转移技术 330

第一节 嵌合体小鼠的产生 330

二、用于囊胚注射的显微注射系统 332

三、囊胚选择性显微注射以产生嵌合体 333

四、逆转录病毒感染胚胎及子宫内注射 336

五、小鼠两细胞胚胎的电融合 337

六、嵌合度检测 338

二、制作固定吸管和注射吸管 339

第二节　小鼠胚胎的核移植 339

一、胚胎分离 339

四、细胞核注入无核单细胞 340

三、去除卵细胞核 340

第五章　转基因鼠的分析 342

第一节　转基因鼠中外源基因的分析 342

一、从鼠尾中提取高分子量的DNA 343

第二节 目标DNA的提取 343

二、从9.5天P.C的卵黄囊或晚期胚胎中提取高分子量DNA 344

一、检测植入后鼠胚的少量小基因片段 345

第三节 鼠胚胎少量小片段DNA的PCR检测 345

二、胚胎组织或卵黄囊匀浆的PCR分析 346

二、转基因产物或表型的定量 347

一、转移基因的定量 347

第四节　确立纯合子转基因鼠或胚胎 347

第五节 克隆转基因与宿主DNA接合部 348

六、用侧翼引物做PCR分析 348

三、分裂间期核的原位杂交 348

四、繁殖测试 348

五、用一个侧翼探针进行Southern blot分析 348

一、用转基因筛选入噬菌体文库 349

一、鼠细胞的核型分析及显带 350

第六节 鼠细胞的核型分析及染色体整合基因定位 350

二、质粒回收和反向PCR 350

二、原位杂交定位染色体的整合基因 352

一、选择适用于谱系分析的转基因动物 354

第七节　转基因鼠的报告基因检测 354

三、β-半乳糖苷酶（LacZ）活性染色 355

二、三种不同的转基因表达模式 355

四、检测带有多种珠蛋白基因的转基因细胞的DNA-DNA原位杂交技术 357

第一节　报告基因在研究转基因鼠胚胎的转录规律中的应用 359

第六章　报告基因与细胞标记在细胞谱系研究中的应用 359

一、报告基因的设计 360

二、功能检验 362

三、分离与纯化注射用DNA片段 363

四、报告基因活性的整胚染色 364

五、转染基因的PCR鉴定 365

六、报告基因的表达分析 366

七、注意事项 367

一、细胞标记和植入确定细胞谱系与命运图谱 370

第二节　植入后鼠胚胎中的细胞嫁接与标记 370

二、培养6.5～8.5天P.C的胚胎 371

三、用于植入的组织块的分离 372

四、对6.5天胚胎的细胞植入与标记 373

五、标记与植入 374

六、被标记胚胎的分析 375

七、注意事项 376

一、体外培养系统 378

第一节　胚胎体外培养系统 378

第七章　各阶段胚胎的体外分离、培养 378

二、培养中的注意事项 380

二、着床前胚胎或囊胚的获取 381

一、收集及转移胚胎用吸管的制作 381

第二节　获取植入前胚胎或囊胚 381

三、植入前各阶段胚胎所需培养液的准备 386

一、植入后各阶段胚胎的分离 390

第三节　植入后各阶段胚胎的分离、培养 390

二、植入后胚胎和组织的培养 396

一、植入后各阶段胚层及生殖细胞的分离 397

第四节　植入后各阶段胚层及生殖细胞的分离及培养 397

二、从不同阶段胚胎获得的原始胚芽细胞的培养 400

三、畸胎瘤细胞的培养 402

一、肾被膜下组织的植入 403

第五节 肾被膜下组织移植及卵巢移植 403

二、卵巢的移植 404

一、胚胎干细胞的体外培养 406

第一节　胚胎干细胞的培养 406

第八章　小鼠胚胎干细胞的实验操作 406

二、滋养层细胞的制备 408

一、选择宿主鼠系，产生纯合子突变 410

第二节　胚胎干细胞的获得与分离 410

二、胚胎干细胞的分离 412

一、设计靶载体、制备用于电穿孔的DNA 414

第三节 胚胎干细胞外源DNA导入及DNA检测 414

二、电穿孔法将DNA导入ES细胞 415

三、单个胚胎干细胞克隆的分离及DNA检测 416

一、干细胞生物工程 422

第一节 干细胞生物工程 422

第九章 干细胞生物工程与多能干细胞的分离和鉴定技术 422

二、干细胞研究所面临的问题 423

三、干细胞治疗和免疫排斥 424

一、干细胞培养条件的确定 425

第二节 多种干细胞的体外培养和分离技术 425

二、从组织块中分离干细胞 427

二、单层培养克隆法 429

一、克隆化培养及其意义 429

第三节 单克隆细胞的培养和分离 429

三、悬浮细胞的克隆 431

五、悬浮克隆的分离 432

四、用克隆环分离克隆 432

一、密度梯度离心分离法 433

第四节 离心、磁珠、荧光激活等分离方法 433

四、其他基于抗体的分离方法 434

三、荧光激活细胞分离法 434

二、磁激活细胞分离法 434

三、体外多向分化和横向分化功能的检测 435

二、增殖能力 435

第五节 干细胞生物学性状的检测 435

一、克隆形成能力和自我维持能力的体外检测 435

五、其他检测技术 437

四、基于抗体的鉴定技术 437

二、基因组分子多态的生物学特征 439

一、基因组研究的意义 439

第十章　小鼠基因组研究与单细胞RT-PCR cDNA消减杂交 439

第一节　小鼠基因组研究 439

三、单核苷酸多态性（SNP）研究 440

四、SNP分析的方法 442

二、试剂材料准备 445

一、简介 445

第二节 单细胞RT-PCR cDNA消减杂交 445

三、实验方法步骤 447

一、哺乳动物胚胎的冻存的发展 450

第一节　哺乳动物胚胎的慢冻存 450

第十一章　受精卵与胚胎的冻存处理与胚胎性别鉴定 450

二、冷冻保护剂的选择和冻存方法 451

三、冷冻保护剂冻存中的注意事项 452

二、材料和方法 453

一、概述 453

第二节　哺乳动物胚胎的玻璃化冻存 453

三、注意事项 455

一、利用逆转录病毒DNA分子探针确定性别 457

第三节 鼠胚胎性别鉴定 457

一、部分肝脏切除 458

第四节　小鼠组织外科分离 458

二、通过羊膜细胞核的染色来区别胚胎的性别 458

第五节　从鼠胚胎组织中分离总RNA 459

四、尾静脉采血 459

二、脾切除 459

三、肾切除 459

三、注意事项 460

二、方法步骤 460

一、材料试剂 460

二、固定 461

一、取材 461

第十二章　小鼠胚胎标本的制作及基因、基因产物检测 461

第一节　小鼠胚胎标本的制作 461

三、包埋与切片 462

四、整胚包埋或整装标本 463

一、组织固定、包埋与切片 464

第二节　小鼠胚胎组织切片的免疫组化及原位杂交检测 464

二、胚胎切片的免疫组化染色 467

三、利用RNA探针进行切片放射性原位杂交染色 468

四、胚胎切片非放射性原位杂交 473

一、全胚标本的免疫组化染色 477

第三节 全胚标本的免疫组化染色与凋亡检测 477

二、程序性细胞死亡的全胚分析 478

第四节　整胚包埋小鼠胚胎标本原位杂交染色 480

一、整胚包埋标本原位杂交 481

二、双色原位杂交 483

三、双色荧光素的原位杂交 487

四、可选择的酶反应底物 488

六、所需的主要试剂和溶液 493

五、原位杂交后whole-mount胚胎组织的包埋及切片 493

三、浮片的杂交 498

二、厚冷冻切片的准备 498

第五节　厚浮片的全胚原位杂交 498

一、石蜡切片的准备 498

第六节 基因转录与基因表达产物同时定位的检测 499

四、探针在浮片上的免疫定位 499

二、过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP） 500

一、利用辣根过氧化物联结的二抗对组织的免疫定位 500

三、抗生物素-生物素-过氧化物酶（ABC）染色 501

二、小鼠牙乳头细胞培养 502

一、小鼠牙胚培养 502

第十三章 小鼠牙胚发育与腭裂动物模型的建立与分析 502

第一节 小鼠牙胚及相关细胞培养 502

二、小鼠牙胚特异基因的筛选 503

一、小鼠牙胚cDNA文库的构建 503

第二节　小鼠牙胚cDNA文库的构建等 503

一、常用的实验动物模型 505

第三节　腭裂小鼠动物模型 505

三、小鼠已知特异牙胚基因的克隆 505

二、影响腭裂发生率的因素 506

二、小鼠腭突正常发育与腭裂形成中差异cDNA文库的建立 508

一、腭裂模型的建立 508

第四节　小鼠腭部发育与腭裂形成中差异cDNA文库的建立 508

三、文库的鉴定 509

一、消减杂交技术在发育畸形研究中的意义 510

第五节 消减杂交技术筛选腭裂形成相关基因 510

四、结果分析 510

二、改良消减杂交方法 511

第十四章 小鼠神经嵴细胞、外胚间充质细胞及神经系统组织细胞的培养 512

第一节 神经嵴细胞的培养方法 512

一、培养基 512

二、神经嵴细胞分离培养方法 512

三、神经嵴细胞的生长情况和鉴定 513

四、神经嵴细胞取材过程中所需要注意的问题 513

第二节 外胚间充质细胞的培养 514

一、材料和器械 514

二、分离培养步骤 514

第三节 神经组织切片培养的解剖准备步骤及切片培养 515

一 、基本原则 515

二、仪器和设备 516

三、解剖和组织准备 516

四、神经组织切片的培养 517

一、Sehwann细胞裂解和培养 518

二、用抗小鼠IgG包被塑料培养瓶 518

三、成纤维细胞的免疫吸附 518

第四节 从外周神经培养基中纯化鼠施万细胞 518

第五节 新生鼠星形胶质细胞和神经元的原代培养 519

第六节 新生鼠脑少突胶质前体细胞及少突胶质细胞的培养 520

第七节 成星形细胞的分离和星形细胞的原代培养 521

第一节 骨髓基质细胞与骨髓基质干细胞的培养 523

一、骨髓基质干细胞概述 523

第十五章　小鼠骨软骨组织来源细胞的培养 523

二、骨髓基质细胞的培养 524

三、骨髓基质干细胞体外分离和纯化 525

四、骨髓基质干细胞的培养 526

五、MSCs向骨组织的定向诱导分化 527

六、骨髓基质干细胞在骨组织工程中的应用研究 527

第二节 骨、软骨细胞的培养 528

一、软骨细胞的培养 528

二、小鼠成骨细胞的培养 529

第三节 骨髓与外周血中树突状细胞的培养 530

一、树突状细胞的起源和发育 530

二、树突状细胞在免疫反应中的作用与地位 531

三、以树突状细胞作为肿瘤疫苗研究的现状 532

四、树突状细胞的分离、诱导与实验室培养 533

五、分离诱导培养DC的方法 535

第一节　器官培养在发育生物学的应用 537

一、器官培养的条件 537

第十六章　组织重组与器官培养 537

二、部分器官的器官培养 538

三、全胚胎的器官培养 539

四、组织相互作用分析中的器官培养：牙胚模型 542

第二节　胶原凝胶中组织的重建 544

一、简介 544

五、器官培养的限制 544

二、主要试剂材料 545

三、组织分解与胶原制备 546

四、将组织植入三维胶原凝胶 546

五、检测分析 547

六、注意事项 548

附录1 主要参考文献 551

附录2 英汉词汇对照 569