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第一篇实验理论 1

第一章吸收光谱法 1

第一节光谱分析基础知识 1

一、光的基本性质 1

二、吸收光谱 2

三、物质颜色与光吸收 2

第二节光吸收的基本定律 3

一、吸光度与透光率 4

二、吸收光谱分析的基本定律 4

三、吸光系数 4

四、偏离Beer定律的因素 5

第三节吸收光谱法的应用 6

一、定性分析 6

二、定量分析 7

三、吸收光谱分析的条件控制 8

第四节分光光度计的基本结构和使用 9

一、分光光度计的基本结构 9

二、分光光度计的使用与要求 10

第二章电泳技术 12

第一节电泳的基本原理和分类 12

一、电泳的基本原理 12

二、电泳的迁移率 13

三、电泳的分类 13

第二节电泳的影响因素 14

一、样品的性质 14

二、电场强度 14

三、缓冲液的性质 14

四、支持介质 15

第三节区带电泳 15

一、醋酸纤维薄膜电泳 15

二、琼脂糖凝胶电泳 16

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 16

第四节特殊的电泳 21

一、等电聚焦电泳 21

二、双向电泳 21

第五节电泳后的染色 22

一、蛋白质的染色 22

二、核酸的染色 23

第三章层析法 24

第一节层析法的原理与分类 24

一、层析法的基本原理 24

二、层析法的分类 24

三、柱层析的基本组成 25

第二节常用的层析法 26

一、薄层吸附层析 26

二、分配层析 27

三、离子交换层析 28

四、凝胶层析 29

五、亲和层析 32

六、高效液相层析 33

第四章酶学分析 34

第一节酶的分离纯化及鉴定 34

一、酶的分离纯化 34

二、酶制剂的鉴定 34

第二节酶活性测定 35

一、酶活性测定方法 35

二、酶的活性单位 36

第三节酶促反应动力学研究 37

一、底物浓度对酶促反应速度的影响 37

二、温度对酶促反应速度的影响 37

三、pH值对酶促反应速度的影响 38

四、激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响 38

五、酶促反应样品及参比溶液的设定 38

第四节酶法分析 38

一、单酶反应定量法 39

二、耦联酶反应定量法 40

第五节同工酶分析 40

第六节酶在生物医学上的应用 41

一、酶在疾病诊断中的应用 41

二、酶在疾病治疗中应用 42

第五章蛋白质的分离与纯化 43

第一节蛋白质分离纯化的原理和基本方法 43

一、沉淀法 43

二、透析与超滤 44

三、超速离心 45

四、层析 45

五、电泳 45

第二节选择蛋白质分离纯化方法的策略 45

第三节蛋白质的制备 46

一、材料的选择与预处理 46

二、细胞的破碎 46

三、提取 46

四、分级分离步骤 47

五、结晶 47

第四节蛋白质的浓缩、干燥和保存 47

一、浓缩 47

二、干燥 48

三、样品的保存 48

第六章核酸的分离纯化与鉴定分析 49

第一节核酸分离纯化 49

一、核酸分离纯化的原则及要求 49

二、核酸提取的主要步骤 49

三、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 51

第二节核酸的鉴定与分析 52

一、紫外分光光度法的定量、定性分析 52

二、核酸凝胶电泳 52

三、聚合酶链反应（PCR）技术 54

第二篇实验篇 58

第七章基础性实验 58

实验一蛋白质含量的测定 58

一、酚试剂法 58

二、BCA法 60

三、双缩脲法 61

四、紫外吸收法 62

实验二核酸含量的测定 64

一、二苯胺法测定DNA含量 64

二、地衣酚法测定RNA含量 65

三、紫外分光光度法分析核酸的纯度及浓度 66

实验三肾上腺素与胰岛素对血糖浓度的影响——邻甲苯胺法测定血糖浓度 68

实验四血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 70

实验五血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 72

实验六SDS-PAGE测定蛋白质分子量 74

实验七氨基酸的纸层析 77

实验八离子交换层析分离混合氨基酸 78

实验九凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白 80

实验十血清谷丙转氨酶酶活性测定（改良Mohun法） 82

实验十一底物浓度对酶活性的影响——碱性磷酸酶Km值的测定 85

实验十二温度和pH值对酶活性的影响 87

实验十三丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 89

第八章综合性实验 91

实验十四常见血液生化指标的酶终点法分析 91

一、酶法测定血清甘油三醋 91

二、酶法测血清胆固醇 93

三、磷钨酸——镁沉淀法（PTA-Mg2+法）测定血清HDL-C含量 94

四、酶法测定血液葡萄糖 95

实验十五乳酸脱氢酶（LDH）的分析 97

一、血清乳酸脱氢酶（LDH）总活性测定 97

二、血清乳酸脱氢酶同工酶分离——琼脂糖凝胶电泳法 98

实验十六血清免疫球蛋白IgG的分离纯化与鉴定 101

一、IgG的分离与纯化 101

二、IgG制品鉴定法 103

实验十七谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的表达及纯化 105

一、细菌转化、培养和GST融合蛋白的诱导表达 105

二、Westernblotting检测GST融合蛋白表达 106

三、亲和层析纯化GST融合蛋白 108

四、SDS-PAGE鉴定GST融合蛋白的纯度 109

实验十八外周血白细胞基因组DNA的分离纯化、鉴定与分析 110

一、外周血白细胞DNA的提取（NaI法） 110

二、紫外分光光度法分析DNA的纯度及浓度 111

三、DNA的琼脂糖凝胶电泳 111

四、聚合酶链反应（PCR） 112

实验十九小鼠肝组织细胞RNA的分离纯化、鉴定与分析 114

一、TRIzol法提取RNA 114

二、紫外分光光度法分析RNA的纯度及浓度 115

三、RNA的甲醛变性凝胶电泳 115

四、逆转录PCR（RT-PCR） 116

实验二十质粒DNA的提取、酶切和电泳分析 118

一、SDS-碱裂解法小量制备质粒DNA 118

二、质粒DNA限制性内切酶酶切分析 120

三、质粒DNA酶切产物的非变性PAGE分析 120

第九章研究设计性实验 122

实验二十一碱性磷酸酶的分离纯化、鉴定及酶动力学实验 122

实验二十二载脂蛋白AI的原核表达、分离纯化及鉴定分析 123

附录 124

附录一生物化学实验须知 124

附录二实验室基本操作 125

附录三试剂分级及常用酸碱溶液 129

附录四常用缓冲液和试剂的配制 130

参考文献 136