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第一章 核酸的分离与纯化 1

第一节 病毒核酸提取 1

一、病毒DNA的提取 1

二、病毒RNA的提取 2

三、技术应用要点 3

第二节 细菌核酸的提取 4

一、细菌DNA的提取 4

二、质粒DNA的提取 6

三、细菌RNA的提取 7

四、技术应用要点 7

第三节 真菌核酸提取 8

一、DNA的提取（以酵母菌为例） 8

二、RNA的提取（以白色念珠菌为例） 9

三、技术应用要点 9

第四节 藻类核酸提取 9

一、藻类DNA的提取 9

二、藻类RNA的提取 10

三、技术应用要点 11

第五节 原虫核酸提取 11

一、疟原虫核酸的提取（含红内期和蚊期） 11

二、弓形虫核酸的提取 16

三、利什曼原虫核酸的提取 20

四、阿米巴核酸的提取 22

五、阴道毛滴虫核酸的提取 25

六、蓝氏贾第鞭毛虫核酸的提取 27

第六节 蠕虫核酸提取 29

一、吸虫核酸的提取（以日本血吸虫Schistosoma japonicum为例） 29

二、绦虫核酸的提取（以细粒棘球绦虫为例） 30

三、线虫核酸的提取（以旋毛虫Trichinella spiralis为例） 31

第七节 节肢动物核酸提取 33

一、蚊核酸的提取 33

二、蝇核酸的提取 36

三、蜱核酸的提取 38

四、螨核酸的提取 38

第二章 目的基因的获取 40

第一节 己知部分核酸序列目的基因的获取 40

一、已知3端和（或）5端序列目的基因的获取 40

二、已知中间序列目的基因的获取 44

第二节 未知核酸序列目的基因的获取 44

一、已知氨基酸序列的目的基因的获取 44

二、根据同源序列获取目的基因 48

三、筛选基因文库获取目的基因 50

四、抑制性消减杂交技术筛选特异基因 52

第三节 多基因的拼接 56

一、利用Ⅱs型限制内切酶进行多基因拼接 57

二、重叠延伸PCR法进行多基因拼接 57

三、利用重叠延伸PCR法进行DNA的人工合成 58

四、不依赖连接酶的多基因拼接克隆法 60

五、Red/ET同源重组介导的多基因拼接克隆法 61

六、技术应用要点 62

第三章 基因的扩增及鉴定 64

第一节 经典PCR 64

一、材料 64

二、缓冲液 64

三、操作步骤 65

四、技术应用要点 66

第二节 逆转录PCR （RT-PCR） 68

一、材料 69

二、操作步骤 69

三、技术应用要点 70

第三节cDNA末端快速扩增（RACE） 71

一、5'-RACE 71

二、3'-RACE 74

三、技术应用要点 76

第四节 靶序列富集多重PCR （Tem PCR） 78

一、试剂与仪器 78

二、操作步骤 78

三、技术应用要点 79

第五节 基因组步移 79

一、材料 80

二、操作步骤 80

三、技术应用要点 81

第四章 基因的克隆与鉴定 84

第一节 载体的制备 84

一、质粒的小量提取法——碱裂解法 85

二、质粒的小量提取法——快速煮沸裂解法 85

三、质粒的大量提取法——碱裂解法 86

第二节 目的基因与载体的酶切 87

一、酶切位点的设计 87

二、载体和目的基因DNA酶切 88

三、从凝胶中回收DNA 88

第三节 目的基因与载体的连接 89

一、黏末端连接（单一酶切） 90

二、黏末端连接（双酶切） 90

三、平末端连接（T4 DNA酶直接连接法） 91

四、平末端连接（同聚物加尾法） 93

五、平末端连接（其他方法） 94

六、黏-平末端连接 95

七、T-A克隆法 96

八、PCR产物的非酶连接法快速克隆 98

第四节 重组体的转化 100

一、感受态细胞的制备——CaC12制备法 100

二、重组DNA转化宿主细胞 101

第五节 重组子的筛选和鉴定 102

一、遗传学表型筛选的方法之一——抗药性筛选 102

二、遗传学表型筛选的方法之二——a互补 103

三、依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一——快速裂解菌落鉴定分子大小 104

四、依赖于重组子结构特征分析的筛选法之二——限制性内切酶酶切方法 104

五、依赖于重组子结构特征分析的筛选法之三一——PCR法 105

六、DNA序列测定 105

第五章 基因的表达与分析 106

第一节 原核表达 106

一、原核表达载体的重要元件 106

二、重组蛋白在原核系统中表达的几种类型 107

三、感受态细胞的制备 108

四、重组载体的构建——目的基因定向克隆 109

五、转化与表达 112

六、技术应用要点 114

第二节 真核表达 115

一、宿主细胞的选择 116

二、载体的构建 116

三、转染与表达 117

第三节 无细胞表达 129

一、兔网织红细胞裂解表达系统（TNT？ Coupled Reticulocyte Lysate Systems） 130

二、大肠杆菌无细胞系统 130

三、技术应用要点 131

第六章 表达产物的分离、纯化与鉴定 133

第一节 样品的制备 133

一、样品制备的原则 133

二、样品制备流程 133

三、重组表达蛋白样品的制备 133

四、包涵体蛋白的纯化 135

第二节 电泳 136

一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 136

二、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 143

三、等电聚焦电泳 145

四、技术应用要点 151

第三节 透析 153

一、材料 153

二、方法 153

三、透析的其他用途 153

第四节 亲和层析 154

一、溴化氰活化的琼脂糖亲和层析 154

二、谷胱甘肽琼脂糖亲和层析 155

三、技术应用要点 156

第五节 表达产物鉴定 158

一、免疫印迹法 158

二、蛋白质一级结构测定（质谱法） 164

第七章 蛋白质功能 169

第一节 蛋白质功能的理论预测 169

一、蛋白质数据库介绍 169

二、蛋白质序列分析 172

第二节 酶的功能 173

一、酶的组织细胞化学技术 174

二、同工酶技术 180

第三节 蛋白质的细胞及组织定位 192

一、免疫荧光技术 192

二、免疫酶染色技术（间接法） 193

三、免疫胶体金技术（IGS法） 194

四、组织免疫金银技术（Histo Gold法） 195

五、免疫电镜技术 195

第四节 受体蛋白及信号转导蛋白的功能研究 196

一、靶标分子作用受体的筛选与鉴定 197

二、靶标蛋白作用信号通路的筛选 197

三、磷酸化的信号转导分子的鉴定 197

四、信号转导中第二信使含量的测定 198

五、激酶活性的测定 199

六、信号转导蛋白在通路中的功能研究 200

第五节 蛋白质相互作用 201

一、免疫共沉淀技术 201

二、酵母双杂交技术 202

三、BIAcore 203

第八章 芯片技术 207

第一节 基因芯片 207

一、基因芯片的工作原理及应用 207

二、基因芯片的操作步骤 208

三、基因芯片的制备 208

四、技术应用要点 210

第二节 蛋白芯片 211

一、蛋白芯片的工作原理及应用 211

二、蛋白芯片的制备 211

三、技术应用要点 213

第三节 细胞芯片 213

一、原理 213

二、细胞芯片的分类和应用 213

第九章 组学技术 215

第一节 基因组学 215

一、鸟枪法测序 215

二、酵母人工染色体 217

三、细菌人工染色体 219

第二节 转录组学 221

一、表达序列标签 221

二、基因表达系统分析 223

三、大规模平行信号测序系统 227

第三节 蛋白质组学 228

一、蛋白质样品的制备 228

二、大规模蛋白质分离 232

三、质谱分析技术 245

四、生物信息学分析 248

五、技术应用要点 248

第四节 抗体组学 250

一、噬菌体抗体库 251

二、核糖体展示 254

第十章 基因多态性及种群遗传 261

第一节SNP 261

一、试剂 261

二、操作步骤 262

三、技术应用要点 264

第二节 点突变 264

一、聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP） 264

二、变性梯度凝胶电泳（DGGE） 267

第三节 微卫星 271

一、ISSR-PCR技术 271

二、SSR标记 275

第四节 片段长度多态性 279

一、聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性 279

二、随机扩增多态性DNA （RAPD）技术 282

三、扩增片段长度多态性（AFLP） 284

四、相关序列扩增多态性（SRAP） 287

第五节rDNA及mtDNA 291

一、rDNA 291

二、mtDNA 293

第六节 进化分析 295

一、基于DNA序列的系统发育重建的一般步骤及相关软件 295

二、序列比对与数据准备 297

三、系统发育树的构建与检验 300

四、技术应用要点 303

第十一章 免疫学技术 306

第一节 多克隆抗体的制备 306

一、抗原的制备 306

二、动物免疫 310

三、抗血清的获取及抗体纯化与鉴定 311

四、替代技术 313

五、技术应用要点 313

第二节 单克隆抗体的制备 314

一、主要器材与试剂 314

二、动物免疫 315

三、SP2/0细胞培养 315

四、饲养层细胞和融合用小鼠脾细胞的制备 315

五、细胞融合和杂交瘤细胞的选择性培养 316

六、培养和观察 316

七、单克隆抗体的检测与克隆化培养 316

八、单克隆抗体的鉴定 316

九、单克隆抗体的大量制备 317

第三节 体液免疫检测 317

一、ELISA 317

二、免疫印迹 319

三、间接荧光抗体试验（IFAT） 321

四、间接血凝试验（IHA 322

五、核素示踪技术 323

六、技术应用要点 324

第四节 细胞免疫检测 325

一、免疫细胞的分离 325

二、细胞因子的检测 327

三、细胞免疫检测其他技术 329

四、技术应用要点 330

第十二章 疫苗研究 332

第一节 减毒活疫苗 332

一、疟原虫辐射减毒子孢子制备 332

二、血吸虫减毒活疫苗 335

第二节 蛋白质及多肽疫苗 338

一、材料与试剂 338

二、操作步骤 338

第三节 核酸疫苗 345

一、核酸疫苗的构建 346

二、核酸疫苗的制备 347

三、弓形虫主要表面抗原单价基因疫苗的构建 350

四、核酸疫苗的免疫接种途径 354

第四节 细胞疫苗 354

一、免疫原制备 355

二、抗原的免疫原性分析 356

三、免疫小鼠方案 356

四、免疫保护效果研究方法 356

第五节 佐剂的类型与选择 357

一、免疫佐剂的分类 357

二、免疫佐剂的作用机制与使用原则 357

三、佐剂的类型与选择 358

第十三章 诊断技术 365

第一节 核酸诊断 365

一、Real-time PCR 365

二、环介导的核酸恒温扩增法 372

三、探针检测 374

第二节 免疫学诊断（抗原和抗体检测） 375

一、酶联免疫吸附试验 376

二、胶体金标记技术 378

三、PCR-ELISA技术 381

第十四章 转基因技术 384

第一节 转基因动物的研究方法 384

一、显微注射法 385

二、逆转录病毒感染法 386

三、胚胎干细胞技术 387

四、精子载体技术 388

五、胚胎分割与细胞核移植 389

第二节 转基因植物的研究方法 390

一、常用的植物转化方法 390

二、常用的转基因植物检测方法 396

第三节 转基因疟原虫 404

一、基本原理 405

二、操作步骤 405

三、技术应用要点 407

第四节 转基因弓形虫 408

一、外源基因转染弓形虫 408

二、转基因弓形虫研究示例 409

第五节 转基因蚊 410

一、转基因蚊的基本原理 410

二、转基因蚊的常用方法 411

三、转基因蚊研究的应用前景 413

第六节RNAi技术 413

一、RNAi穿梭质粒pSIREN-astl的构建 413

二、RNAi腺病毒骨架质粒pAd-hTR的构建 416

三、RNAi腺病毒的包装、扩增、纯化 418

四、对照重组腺病毒Ad-NT siRNA的构建 421

五、杜氏利什曼原虫四川人株（H2株）无鞭毛体的培养及感染 421

六、荧光定量PCR检测hTRmRNA水平 422

七、杜氏利什曼原虫无鞭毛体毒力基因的鉴定 423

第十五章 微生物培养技术 426

第一节 病毒培养技术 426

一、动物接种 426

二、鸡胚培养法 427

三、组织培养法 428

四、病毒培养模式举例 431

五、细胞病变观察及病毒量测定 432

六、技术应用要点 435

第二节 细菌培养技术 435

一、普通细菌培养技术 436

二、正常菌群及厌氧菌的培养技术 441

三、基因工程受体菌的培养 446

第三节 真菌培养技术 448

一、真菌培养的一般方法 448

二、常用真菌培养基 449

三、技术应用要点 453

第四节 立克次体培养技术 453

一、立克次体的一般培养方法 454

二、常见病原性立克次体的培养 454

三、技术应用要点 455

第五节 支原体培养技术 455

一、主要试剂配制 455

二、支原体基础培养基制备 456

三、重要支原体培养基模式举例 457

四、支原体培养方法 458

五、菌种的纯化与鉴定 458

六、支原体菌数测定法 459

七、技术应用要点 459

第六节 衣原体培养技术 460

一、衣原体培养的一般方法 460

二、常见病原性衣原体培养 461

三、技术应用要点 461

第十六章 寄生虫培养技术 463

第一节 疟原虫的体外培养 463

一、材料及有关试剂配制 463

二、培养步骤 464

三、疟原虫的克隆 466

四、疟原虫的液氮保种 467

五、低温冻存疟原虫的复苏 467

六、从体外培养的感染血中浓聚恶性疟原虫（Percoll法） 468

七、从疟疾患者感染血中去除白细胞（明胶法） 469

八、从疟疾患者感染血中浓聚间日疟原虫（Percoll法） 469

九、从感染血中分离疟原虫（皂素法） 469

第二节 溶组织内阿米巴培养 470

一、培养基的配制与操作步骤 470

二、技术应用要点 471

第三节 锥虫培养 472

一、锥虫前鞭毛体的培养 472

二、锥虫血液型在小鼠模型中的传代和纯化 473

三、锥虫血液型的体外培养 474

四、用饲细胞体外培养锥虫血液型 475

第四节 血吸虫培养 477

一、溶液制备 477

二、虫卵培养 479

三、毛蚴转化与母胞蚴培养 479

四、尾蚴胚胎培养 480

五、童虫培养 480

六、成虫培养 482

第十七章 寄生虫病传播模型的构建技术 483

第一节 寄生虫病生态模型的构建 483

一、操作步骤 483

二、技术应用要点 486

第二节 寄生虫病干预模型的构建 487

一、蠕虫病化疗干预模型 487

二、疫苗接种干预模型 488

第三节 模型的验证 488

一、验证过程 488

二、验证方法 488

第四节 常见寄生虫病模型的构建 492

一、疟疾流行模型 492

二、弓形虫感染模型 494

三、黑热病流行模型 495

四、血吸虫病流行模型 495

五、丝虫病流行模型 496

六、包虫病传播模型 497

第十八章 生态学研究技术 500

第一节 个体生态研究方法 500

一、实验室观察 500

二、现场观察 500

三、技术应用要点 501

第二节 种群生态研究方法 501

一、种群基本结构特征研究方法 501

二、种群空间分布格局研究方法 503

三、种群季节消长研究方法 505

四、其他研究方法 505

五、技术应用要点 505

第三节 群落生态研究方法 506

一群落基本结构研究方法 506

二、种多度分布 508

三、群落内总物种数估测 508

四、群落内物种之间相互关系的研究方法 509

五、群落相似性研究方法 510

六、群落数量分类 511

七、技术应用要点 513

第四节 区系研究方法 513

一、现场调查取样 514

二、分类鉴定 514

三、技术应用要点 515

第十九章 监测技术 517

第一节 疫情监测 517

一、操作步骤 517

二、技术应用要点 518

第二节 病原体识别与筛查 519

一、操作步骤 519

二、技术应用要点 520

第三节 预警与预测 523

一、遥感技术 523

二、地理信息系统 524

第二十章 预防控制效果评价技术 530

第一节 卫生经济评价方法 530

一、成本估计 531

二、效果估计 531

三、成本效果分析 531

第二节 标准组群抽样方法 533

一、抽样方法 533

二、抽样步骤 533

三、样本量的计算 534

四、技术应用要点 534

第三节 质量检验抽样法 534

一、操作步骤 535

二、技术应用要点 536

第四节 捕获-标记-再捕获法 537

一、原理 537

二、操作步骤 537

第五节 德尔菲（Delphi）评价法 537

一、方法 538

二、操作步骤 538

第二十一章 其他技术 540

第一节 膜片钳技术 540

一、基本原理 540

二、膜片钳记录的方式 542

三、操作步骤 544

四、几种离子通道电流的测定 547

五、膜片钳制技术的应用举例 552

第二节 共聚焦激光扫描显微技术 553

一、结构与原理 553

二、图像的三维重建 554

三、荧光探针和荧光标记物 555

四、双光子（多光子）显微镜 559

五、共聚焦激光扫描显微镜检测技术应用举例 559

六、共聚焦显微镜检测斯氏狸殖吸虫成虫抗原的定量分析实例 560

第三节 组织细胞中一氧化氮的检测 561

一、电化学方法 561

二、ESR方法 562

三、cGMP检测 562

四、瓜氨酸含量的测定 562

五、NO2-/NO3-含量的测定 562

六、形态学方法 563

七、血红蛋白测定方法 563

八、化学发光法 563

九、分子生物学技术 564

第四节 细胞凋亡常用的研究方法 564

一、形态学观察方法 564

二、琼脂糖凝胶电泳法 566

三、流式细胞仪分析 567

四、原位末端标记法（TUNEL法） 568

第五节RNA分析技术 569

一、核酶 569

二、RNA编辑（RNA editing） 572

三、核仁小分子RNA （snoRNA） 576

四、小分子RNA （microRNA） 578

第六节 虫源性药物的开发技术 581

一、虫体内抗菌肽的提取 582

二、化学合成法 584

三、基因工程法 584

第二十二章 动物模型 586

第一节 病毒感染动物模型 586

一、呼吸道病毒动物模型 586

二、轮状病毒动物模型 589

三、柯萨奇病毒动物模型 589

四、肝炎病毒动物模型 590

五、疱疹病毒动物模型 591

六、虫媒病毒动物模型 592

七、逆转录病毒动物模型 595

第二节 细菌动物模型 596

一、脑膜炎双球菌新生大鼠模型 596

二、肺炎克雷伯菌小鼠模型 597

三、幽门螺杆菌动物模型 597

四、结核分枝杆菌动物模型 597

第三节机会感染性真菌动物模型 598

一、肺孢子菌动物模型 598

二、白假丝酵母菌动物模型 600

三、新生隐球菌动物模型 602

第四节 肺炎支原体动物模型 603

一、肺炎支原体的培养及菌数测定 603

二、动物感染 603

三、模型鉴定方法 603

第五节 衣原体动物模型 604

一、菌株与动物 604

二、试剂 605

三、操作步骤 605

第六节 原虫动物模型 606

一、蓝氏贾第鞭毛虫动物模型 606

二、杜氏利什曼原虫动物模型 607

三、疟原虫动物模型 608

第七节 蠕虫动物模型 611

一、旋毛形线虫动物模型 611

二、马来丝虫动物模型 612

三、广州管圆线虫动物模型 613

四、日本血吸虫动物模型 614

五、血吸虫肝脏肉芽肿动物模型 615

六、华支睾吸虫病动物模型 616

七、细粒棘球绦虫棘球蚴动物模型 617

第八节 医学昆虫的饲养与病原体感染技术 618

一、蚊虫饲养及感染 618

二、硬蜱的饲养与巴贝虫感染 623

三、其他常用的昆虫饲养方法 625

第九节 机会感染性原虫动物模型的建立 629

一、实验动物的选择及免疫功能不全宿主模型的建立 629

二、弓形虫感染动物模型 630

三、隐孢子虫感染动物模型 631

四、微孢子虫感染动物模型 633