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第一章蛋白质分析的一些方法学问题 1

一、天然蛋白质的研究 1

目 录 1

1．天然蛋白质的电泳 2

2．区带电泳法 4

1）纸电泳 6

2）淀粉凝胶电泳 6

3）琼脂凝胶电泳 7

4）醋酸纤维膜电泳 8

5）丙烯酰胺凝胶电泳 8

1）术语 9

3．通过免疫化学方法研究天然蛋白质 9

2）沉淀反应概况 10

3）免疫扩散法 11

4）免疫扩散法的应用 13

4．蛋白质的离子交换层析 15

5．蛋白质的凝胶过滤分级分离 18

参考文献 22

综合文献 23

二、顺序分析的方法学问题 24

参考文献 37

2．监视和检验实验精确度的方法 41

综合文献 41

1．电泳技术 42

第二章蛋白质低压电泳分析法 42

一、低压纸电泳 42

2．染色方法 50

1）蛋白质的染色法 50

2）脂蛋白的染色法 52

3）糖蛋白的染色法 54

3．蛋白质低压纸电泳结果的测定 57

1）用洗脱法进行定量测定 57

2）用光电比色法进行定量测定 59

4．低压纸电泳方法中一些误差的来源 62

5．蛋白质的测定方法 63

二、醋酸纤维薄膜电泳 68

三、琼脂凝胶电泳 71

1．垂直淀粉凝胶电泳 74

四、淀粉凝胶电泳 74

2．水平淀粉凝胶电泳 76

五、丙烯酰胺凝胶电泳 81

1．丙烯酰胺凝胶区带电泳 81

2．盘状电泳（Disc electrophoresis） 84

参考文献 91

综合文献 92

第三章中压及高压电泳方法 93

一、水平中压电泳仪及其应用 94

二、对角线电泳法 103

1．对角线电泳制备胱氨酸肽 103

2．对角线电泳制备甲硫氨酸肽 105

3．对角线电泳制备组氨酸肽 107

4．对角线电泳分离赖氨酸肽 108

5．从蛋白质的胰酶解产物中分离胰酶解的C－末端肽段 110

三、高压电泳技术 110

参考文献 112

综合文献 112

第四章免疫化学的测定方法 113

一、免疫血清的产生 113

1．不加佐剂的免疫方法 113

2．加用佐剂的免疫方法 115

二、用沉淀反应分析蛋白质 116

1．定性沉淀试验 116

2．用稀释方法测定抗体的滴度 118

3．抗原－抗体等价区的测定 119

4．界面（环状）沉淀试验 120

5．定量沉淀试验 121

三、用凝胶扩散方法分析蛋白质 123

1．简便、线性凝胶扩散法 123

2．线性单向凝胶扩散法（又称试管双向扩散法） 125

3．平面双向凝胶扩散法（又称平板双向凝胶扩散法） 126

4．免疫电泳 133

1）Grabar和William的常量免疫电泳法 133

2）Scheidegger的微量免疫电泳法 136

5．Ossermann的蛋白质比较分析法 145

6．吸附免疫电泳 147

7．免疫凝胶过滤 148

8．电协同扩散对流免疫电泳 149

9．用含抗体的琼脂糖凝胶电泳作蛋白质的定性和定量分析 150

10．定量凝胶扩散法 152

1）Feinberg的抗体梯度方法 152

2）用含有特异性抗体的琼脂平板作蛋白质定量测 154

定 154

3）Backhausz的定量免疫电泳法 155

11．醋酸纤维膜的蛋白质免疫扩散分析 156

1）平面双向扩散 156

2）免疫电泳 156

参考文献 157

综合文献 158

2．蛋白质和肽的还原及羧甲基化 159

第五章蛋白质和肽的水解 159

1．蛋白质和肽的过甲酸氧化 159

一、水解物质的准备 159

二、蛋白质和肽的6N HCl水解 160

三、蛋白质和肽的部分酸水解 161

四、蛋白质和肽的胰蛋白酶水解 161

五、蛋白质和肽的糜蛋白酶水解 163

六、蛋白质和肽的胃蛋白酶水解 163

七、蛋白质和肽的木瓜蛋白酶水解 164

八、蛋白质的溴化氰裂解 164

综合文献 166

第六章用氨基酸自动分析仪定量测定氨基酸 167

参考文献 179

第七章氨基酸与肽的纸层析 180

综合文献 187

一、强酸性肽在Amberlite IR-4B柱上的分级分离 188

第八章肽的离子交换层析 188

二、碱性肽的Amberlite IRC-50柱层析 189

三、肽在Dowex 50×2柱上用不挥发缓冲液分级分离 190

四、肽在Dowex 50×2柱上用挥发性缓冲液分级分离 192

五、肽的CM纤维素柱层析 193

六、肽的DEAE纤维素柱层析 195

综合文献 197

第九章蛋白质的层析 198

一、蛋白质的DEAE纤维素柱层析 198

1．OH－型DEAE纤维素柱 198

2．Cl－型DEAE纤维素柱 200

3．在脲存在下的DEAE纤维素层析 201

综合文献 202

4．血清蛋白的DEAE纤维素柱层析 203

二、蛋白质的阳离子交换纤维素柱层析 206

1．CM纤维素 206

2．血清蛋白在磷酸纤维素（phospho-cellulose）柱上的分级分离 208

3．血清蛋白在CM纤维素柱上的分级分离 209

三、血清蛋白在DEAE葡聚糖凝胶柱上的分级分离 210

四、在DEAE葡聚糖凝胶上通过“分批”技术制备γ球蛋白 213

综合文献 214

第十章蛋白质和肽的凝胶过滤 215

一、蛋白质溶液在葡聚糖凝胶柱上的脱盐 215

二、用葡聚糖凝胶浓缩蛋白质溶液 216

三、血清蛋白通过凝胶过滤进行分级分离 216

四、γG球蛋白的大分子量片段在葡聚糖凝胶柱上的分离 218

8．ε-DNP-Lys的制备 219

五、酶解产物在葡聚糖凝胶G-50柱上的预分级分离 221

六、通过循环凝胶过滤分离蛋白质 223

综合文献 225

第十一章薄层层析 226

一、氨基酸及其衍生物的薄层层析 229

1．DNP－氨基酸 230

2．PTH－氨基酸 231

3．Dansyl－氨基酸 231

4．肽 232

二、薄层凝胶过滤 233

参考文献 236

综合文献 237

第十二章蛋白质与肽的末端分析和逐步降解 238

一、N－末端2,4－二硝基氟苯测定法 238

1．蛋白质二硝基苯化 239

2．DNP－蛋白质或肽的水解与DNP－衍生物的提取 240

3．DNP－氨基酸的纸层析 241

4．以薄层层析鉴定DNP－氨基酸 245

5．DNP－氨基酸的间接鉴定 245

6．DNP－衍生物的定量测定 247

7．DNP－氨基酸的制备 248

二、N－末端氨基酸丹磺酰化测定法 249

1．丹磺酰化技术（Hartley,1970） 250

2．DNS－氨基酸的鉴定 251

1）纸上电泳鉴定DNS－氨基酸 251

2）薄层电泳鉴定DNS－氨基酸 253

3）聚酰胺薄层层析鉴定DNS－氨基酸 255

3．DNS－氨基酸的制备 257

三、以异硫氰酸苯酯降解法测定N－末端顺序 258

四、蛋白质的PTC降解 260

五、肽的Dansyl-Edman顺序分析法 261

六、肽的Edman降解与定量氨基酸分析顺序分析法 262

1．PTH－衍生物的检测 263

2．PTH－氨基酸制备 263

七、用亮氨酸氨肽酶测定N－末端顺序 264

八、肼解法测定C－末端 267

九、羧肽酶消化法测定C－未端顺序 269

参考文献 271

综合文献 271

第十三章氨基酸衍生物的气相色谱分析 272

一、前言 272

二、原理 273

1．方法步骤 274

1）进样 274

2）分离 275

3）检测、记录、计算、鉴定 277

2．方法原理 277

三、气相色谱分析氨基酸衍生物及肽的特殊仪器要求和实验条件 279

1．工作温度 279

2．进样器 280

3．柱填料 281

4．氨基酸分析用的气相色谱仪的要求 283

5．气相色谱图的定量计算 283

四、衍生物的分析性质 284

1．氨基酸衍生物的制备 284

2．保护功能团法制备衍生物 292

3．氨基酸的化学转化法制备衍生物 300

4．氨基酸降解法制备衍生物 301

五、氨基酸的热解反应 302

六、氨基酸衍生物的气相色谱法 302

七、氨基酸定量分析问题 308

八、肽的气相色谱法 311

1．Biemann法 312

2．Weygand法 314

参考文献 325

一、引言 326

第十四章等电点聚焦 326

二、基本原理 327

三、两性载体 328

1．必需具备的条件 328

2．制备方法 329

3．两性载体的性质 329

1．以液体为介质 330

四、等电点聚焦 330

2．以凝胶为介质 336

1）颗粒凝胶为介质 336

2）聚丙烯酰胺凝胶为介质 337

3．等电点聚焦后Ampholine的除去方法 338

参考文献 340

一、序言 341

二、原理 341

第十五章荧光技术 341

三、试剂 342

1．荧光胺的制备及其特性 342

2．对装置及其它化学试剂的要求 343

四、应用范围 344

五、荧光技术在柱层析及非柱层析法中的应用 345

1．非柱层析 345

2．柱层析 347

六、应用实例 351

2．肽与糖肽的分子量测定 351

1．肽的纯化 351

3．用荧光氨基酸分析仪测定蛋白质或肽的氨基酸 355

组成 355

4．肽的氨基酸顺序测定 357

5．肽的合成 358

6．肽的定量分析 359

7．生理研究 360

参考文献 361

第十六章蛋白质和肽顺序的质谱测定 362

一、前言 362

应用范围 365

操作 365

1．N－乙酰全甲基衍生物的制备 365

二、寡肽顺序的质谱测定法 365

原理 365

2．质谱分析 367

评注 369

参考文献 374

一、引言 376

离中的应用 376

第十七章高效液相色谱及其在氨基酸、肽和蛋白质分 376

二、原理 377

三、仪器装置 380

1．高压输液泵 380

2．梯度淋洗装置 381

3．层析柱 381

4．进样器 382

5．检测器 384

四、实验条件选择 384

1．层析填料——固定相 384

2．洗脱液——移动相 386

1．PTH－氨基酸 387

五、应用举例 387

2．小肽分离 388

3．小鼠垂体中β－内啡肽的分离 390

参考文献 392

第十八章蛋白质和多肽的放射免疫分析 393

一、基本原理 393

二、测定的主要条件和步骤 395

三、抗原的制备和标记 396

1．抗原的制备 400

2．抗原的标记 401

3．*Ag的分离纯化 408

4．*Ag的质量鉴定和比放射性测定 411

四、抗血清的制备 419

1．抗血清的产生 419

2．抗血清的质量鉴别 421

五、*AgAb复合物的分离 425

1．双抗体法 425

2．中性盐和溶剂沉淀法 427

3．非特异性吸附法 427

4．免疫特异吸附法 428

六、标准曲线及其制作过程 431

1．标准曲线的制作过程 431

2．标准曲线的其它作图方法 432

七、生物样品测定 434

八、灵敏度及提高灵敏度常用的手段 435

2．提高抗血清的稀释倍数 436

1．降低*Ag用量 436

3．改变加样次序 437

九、精确度及影响精确度的因素 438

1．影响精确度的因素 439

十、附录 441

参考文献 443

第十九章亲和层析 446

一、载体要求 447

二、载体简介 447

1．多孔玻璃载体 447

2．聚丙烯酰胺凝胶载体 447

3．纤维素载体 448

4．葡聚糖凝胶载体 448

5．琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶载体 448

1．多糖类载体活化 451

三、载体活化及偶联 451

2．分子臂的引入及双功能结合剂 455

3．多孔玻璃载体的活化 456

四、亲和吸附和洗脱 459

五、亲和层析应用 461

1．干扰素的提纯 461

2．微管蛋白（Tubulin）的纯化 462

3．DNP标记肽的纯化 466

参考文献 468

英汉名词对照 469