组织和细胞培养技术PDF电子书下载

第一章 引论 1

第一节 组织培养的诞生与发展简史 1

第二节 组织培养常用术语 3

第三节 组织培养常用缩写词（Abbreviations） 6

第二章 组织培养基 9

第一节 培养基的基本要求 9

一、营养成分 9

二、促生长因子及激素 9

三、渗透压 10

四、pH 10

五、无毒、无污染 10

第二节 天然培养基 10

一、血清 11

（一）血清的种类 11

（二）血清的主要成分及主要作用 11

（三）细胞培养中使用血清的缺点 12

（四）血清的质量标准 12

（五）血清的使用与储存 13

二、鼠尾胶原 14

（一）制备方法 14

（二）使用方法 14

三、组织浸出液 14

第三节 合成培养基 15

一、基本培养基 15

（一）基本组分 15

（二）种类 19

（三）如何选择培养基 20

（四）培养基的配制 20

二、无血清培养基 20

（一）无血清培养基的设计思路 21

（二）无血清培养基的基本配方 21

（三）使用方法 22

三、无蛋白培养基（protein free medium，PFM）和限定化学成分培养基 22

（chemical defined medium，CDM） 22

第四节 其他培养用液 23

一、平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS） 23

二、消化液 23

三、pH调整液 24

四、抗生素液 24

五、谷氨酰胺补充液 24

第三章 细胞培养的设备条件与培养物的检查 26

第一节 细胞培养中常用的仪器设备 26

一、无菌室 26

二、超净工作台 26

三、双重纯水蒸馏器 26

四、抽气泵 27

五、压力蒸气消毒器 27

六、电热恒温干燥箱 27

七、电热恒温培养箱 27

八、CO2培养箱 27

九、恒温水浴锅 27

十、液氮生物容器 28

十一、倒置显微镜 28

十二、离心机 28

十三、无菌过滤器 28

十四、洗刷装置 28

十五、细胞计数板和电子细胞计数仪 28

第二节 细胞培养的无菌环境 29

一、无菌室 29

二、超净工作台 30

第三节 常用培养器皿 31

一、玻璃器皿 31

二、塑料器皿 32

第四节 培养器皿的清洗与消毒 32

一、清洗 32

（一）玻璃器皿的清洗 33

（二）橡胶制品的清洗 33

（三）塑料制品的清洗 33

（四）G6除菌滤器的清洗 34

（五）不锈钢除菌滤器的清洗 34

（六）包装 34

二、消毒和灭菌 34

（一）物理消毒法 35

（二）化学消毒法 36

（三）抗生素消毒法 37

第五节 培养物的常用固定、染色方法 37

一、培养物的常用固定方法 38

二、染色方法 39

（一）Giemsa染色法 40

（二）苏木精-伊红（HE）染色法 40

（三）Feulgen染色法 41

（四）吖啶橙染色法 41

（五）免疫荧光染色法 41

（六）免疫金银技术 41

（七）ABC免疫酶标技术——DAB显色法 42

（八）ABC免疫酶标技术——发光底物显色法 43

第六节 光学显微镜术观察的一般过程 43

一、光学显微镜的成像原理、构造与性能 43

二、光学显微镜的种类 44

三、光学显微镜术观察的一般过程 45

（一）普通光学显微镜（normal microscope）技术 45

（二）相差显微镜（phase contrast microscope）技术 45

（三）荧光显微镜（fluorescence microscope）技术 45

（四）暗视野显微镜（dark field microscope）技术 50

（五）偏振光显微镜（polarizing microscope）技术 51

（六）干涉显微镜（interfference microscope）技术 51

（七）扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM）技术 51

（八）原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）技术 52

（九）视频显微镜（video microscope，VM）技术 52

（十）激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）技术 52

第七节 电子显微镜术观察的一般过程 53

一、透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）技术 53

（一）样品制备 53

（二）观察方法 55

二、扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）技术 56

（一）样品制备 56

（二）观察方法 57

三、超高压电子显微镜（ultra-high-voltage electron microscope，UHVEM）技术 57

四、扫描式透射电子显微镜（scanning transmission electron microscope，STEM）技术 58

第八节 细胞培养中常用的特殊染色方法 58

一、培养细胞的活体染色方法 58

二、细胞内糖类染色方法——过碘酸席夫反应法（periodic acid Schiff reaction，PAS） 58

三、细胞的脂类染色方法——苏丹红Ⅲ染色法 59

四、细胞骨架的染色方法 59

（一）微丝的显示方法 59

（二）微管的显示方法 60

五、Feulgen反应显示DNA 60

六、甲基绿-派若宁法（methyl green-pyronin method）显示DNA和RNA 61

七、DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法 61

第九节 培养物的污染及防止 62

一、污染途径 62

二、污染对培养细胞的影响及污染的检测 62

（一）细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测 63

（二）真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 63

（三）支原体污染对细胞的影响及污染物的检测 63

（四）病毒污染对细胞的影响及污染物的检测 65

（五）细胞交叉污染对细胞的影响及污染物的检测 66

三、污染的预防 66

四、污染的排除 66

第四章 体外培养的基本组织 69

第一节 上皮组织 69

一、内皮细胞的培养 69

（一）血管内皮细胞（vascular endothelial cell）的培养 69

（二）淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cell）的培养 73

二、单层柱状上皮细胞的培养 76

（一）胃粘膜上皮细胞的培养 76

（二）肠粘膜上皮细胞的培养 77

三、假复层纤毛柱状上皮细胞的培养 78

四、复层扁平上皮细胞的培养 80

（一）表皮细胞（epidermal cell）的培养 80

（二）食管粘膜上皮细胞的培养 82

第二节 结缔组织 83

一、成纤维细胞的培养 83

（一）消化分离法 83

（二）植块培养法 84

二、巨噬细胞的培养 85

（一）腹膜腔巨噬细胞（peritoneal macrophage）培养法 85

（二）肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage）的培养 86

三、脂肪细胞的培养 86

（一）大鼠前脂肪细胞的培养 87

（二）小鼠前脂肪细胞的培养 87

四、肥大细胞的培养 88

（一）皮肤肥大细胞的培养 88

（二）肺肥大细胞的培养 89

（三）肠肥大细胞的培养 90

五、血细胞的培养 91

（一）Ficoll-Hypaque分离法 91

（二）Percoll分离法 92

六、淋巴细胞的培养 93

（一）淋巴液中淋巴细胞的培养 93

（二）淋巴结中淋巴细胞的培养 94

（三）血液中淋巴细胞的培养 94

七、软骨细胞的培养 95

（一）关节软骨细胞的短期培养 95

（二）关节软骨细胞的长期培养 95

八、骨细胞的培养 96

（一）骨内成骨细胞的培养 96

（二）膜内成骨细胞的培养 97

第三节 肌肉组织 98

一、心肌细胞的培养 98

二、平滑肌细胞的培养 99

三、骨骼肌细胞的培养 101

（一）鸟类骨骼肌细胞的培养 101

（二）啮齿类骨骼肌细胞的培养 101

第四节 神经组织 102

一、神经元的培养 102

二、神经胶质细胞的培养 103

（一）星形胶质细胞（astrocyte）的培养 104

（二）少突胶质细胞（oligodendrocyte）的培养 104

（三）施万细胞（Schwann cell）的培养 105

第五节 细胞运动的观察 106

一、噬动轨迹法 106

二、细胞刮除法 107

三、细胞培养池法 108

四、数字影像法 108

第六节 细胞培养的生长测定 109

一、细胞计数法 109

二、台盼蓝染色法 111

三、MTT比色法 111

四、细胞生长曲线法 112

五、［3H］-TdR掺入法 113

六、BrdU掺入法 113

第七节 细胞的冻存、复苏和运输 115

一、细胞的冻存 115

二、细胞的复苏 116

三、细胞的运输 116

第五章 细胞建系和鉴定 118

第一节 正常细胞系的建立和鉴定 118

一、正常细胞系建立程序 119

（一）原代培养 119

（二）传代换液 122

（三）细胞的冻存和复苏 124

二、正常细胞系建立的例证 125

（一）角质表皮细胞（epidernal keratinocytes）建系 125

（二）成纤维细胞培养和建系 126

（三）建立正常细胞系的讨论和小结 127

三、正常细胞系的鉴定 127

（一）形态学 127

（二）细胞染色体分析 128

（三）同工酶检查 129

（四）DNA指纹技术（DNA fingerprinting）检测 130

（五）抗原标记 131

（六）细胞生长实验 132

四、正常细胞系建立和鉴定讨论及小结 132

第二节 癌细胞系、转化细胞系的建立和鉴定 132

一、癌细胞系的建立 133

（一）癌细胞原代培养 133

（二）换液与传代 134

二、癌细胞建系的例证 135

三、转化细胞系建立 136

四、癌细胞和转化细胞建系讨论和小结 138

五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定 138

（一）细胞形态学 139

（二）染色体异常 139

（三）体外生长异常 140

（四）裸鼠移植瘤试验 143

六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的小结及讨论 144

第六章 细胞周期分析与细胞克隆化技术 145

第一节 细胞周期的概念 145

第二节 细胞同步化方法 146

一、材料 147

二、方法 147

（一）使细胞同步化在G0/G1期方法 147

（二）使细胞同步化在G1期 148

（三）使细胞同步化在G1/S期交界点 148

（四）使细胞同步化在有丝分裂期（M期） 149

三、细胞同步化的分析 149

第三节 细胞周期分析方法 150

一、3H-脱氧脲嘧啶掺入法 150

二、测定核酸含量法 150

三、BrdU掺入法 151

四、PCNA法 151

五、Ki-67法 151

六、测定生化活动法 152

七、其他方法 153

第四节 细胞克隆的概念及常用方法 154

一、克隆的基本概念 154

二、细胞克隆培养方法 154

（一）软琼脂培养 154

（二）甲基纤维素半固体培养 155

（三）有限稀释法 155

（四）毛细管吸取单细胞 156

（五）影响克隆形成率的因素 156

第七章 器官培养 157

第一节 器官培养的要求 158

一、器官培养的取材 158

二、培养基 158

三、培养环境中的气体 159

四、培养器官的支持物 159

第二节 器官培养技术的特点 160

一、优点 160

二、不足 160

第三节 器官培养的方法 160

一、固体培养基器官培养法 161

（一）表玻璃器官培养法（watch glass technique） 161

（二）琼脂凝胶器官培养法（Wolff器官培养法） 161

二、液体培养基器官培养法 162

（一）擦镜纸器官培养法 162

（二）金属格栅器官培养法（Trowell technique） 163

（三）琼脂小岛器官培养法 164

（四）Transwell器官培养法 165

三、动态器官培养法 165

（一）灌流式器官培养法 165

（二）旋转管培养法（roller tube culture） 166

（三）摇摆式器官培养法 166

四、体内器官培养法 168

（一）鸡胚尿囊绒膜培养法 168

（二）早期鸡胚胚盘培养法 169

第四节 器官培养的应用 170

一、器官培养在胚胎发育研究中的应用 170

（一）胚胎肢芽的器官培养 170

（二）胚胎性腺的器官培养 171

（三）胚胎器官的上皮与间充质的联合培养 172

（四）全胚胎培养 173

二、器官培养在器官功能及其代谢研究中应用 175

（一）骨的器官培养 175

（二）血管的器官培养 176

（三）肝脏的器官培养 177

（四）毛囊的器官培养 177

（五）胃肠粘膜的器官培养 178

三、器官培养在肿瘤侵袭研究中的应用 179

（一）单细胞侵袭器官培养法1——半固体培养基培养法 179

（二）单细胞侵袭器官培养法2——液体培养基培养法 180

（三）瘤细胞球体器官培养法1——静止球体培养法 181

（四）瘤细胞球体器官培养法2——旋转球体培养法 181

（五）单层细胞器官培养法 182

第八章 干细胞的培养 184

第一节 胚胎干细胞 184

一、胚胎干细胞的培养 185

（一）小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的培养和制备 185

（二）利用小鼠成纤维细胞系作为饲养层细胞 186

（三）小鼠胚胎成纤维细胞或STO滋养板的制备 186

（四）胚胎干细胞的培养 187

（五）ES细胞的冻存 188

（六）ES细胞的复苏 188

（七）ES细胞系的建立 189

（八）ES细胞系的常规培养 189

二、胚胎干细胞的形态特征及其鉴定 191

（一）胚胎干细胞的形态特征 191

（二）胚胎干细胞的鉴定 191

三、胚胎干细胞的体外诱导分化 192

第二节 神经干细胞 192

一、神经干细胞的概念及生物学特征 193

二、神经干细胞的分离与培养 193

（一）胚胎干细胞体外诱导分化为神经细胞 194

（二）成体神经干细胞培养及诱导分化 195

（三）神经干细胞的诱导分化 196

（四）神经细胞形态特征及化学标志 196

三、影响神经干细胞分化的因素 196

（一）体外定向诱导ES细胞分化为神经细胞 196

（二）成体神经干细胞的体外诱导分化 197

（三）神经干细胞的体内分化 197

（四）移植细胞的标记、存活、迁移与分化 197

第三节 造血干细胞 198

一、造血干细胞的定义及生物学特征 198

二、造血干细胞的分离及培养 198

（一）骨髓造血干细胞 198

（二）外周血干细胞 199

（三）脐带血干细胞 199

（四）胎儿造血系统 199

（五）胚胎干细胞和胚胎原始生殖细胞 200

（六）造血干细胞的可塑性 200

第四节 间充质干细胞 200

一、从骨髓细胞中分离MSC细胞 200

二、分离骨髓基质细胞（MDSC） 200

三、流式细胞仪分离MSC和MDSC 201

四、骨髓细胞长期培养（LTBMC） 201

五、人的MSC细胞系培养 202

六、MSC细胞向脂肪细胞谱系分化 202

七、MSC诱导分化为软骨细胞-软骨细胞团试验 203

八、MSCS诱导分化为成骨细胞谱系 203

第五节 表皮组织干细胞 204

第六节 胰岛干细胞 205

一、从人胰腺导管制备胰岛干细胞 206

二、从小鼠胚胎干细胞系定向诱导分化为胰岛干细胞 207

第七节 鉴定干细胞及分化细胞类型的标志 207

第九章 细胞培养在细胞分化研究中的应用 212

第一节 细胞分化概念 212

一、细胞分化的特征 212

二、细胞分化的调控 213

（一）影响细胞分化的作用方式 213

（二）影响细胞分化的活性物质 214

三、细胞分化的分子机制 215

四、细胞分化的调控障碍与疾病 215

（一）畸胎瘤 215

（二）恶性肿瘤 216

第二节 正常细胞的分化研究 217

一、正常细胞分化研究简况 217

二、ES和EG细胞培养和建系的基本技术 218

（一）饲养层细胞 218

（二）胚胎细胞来源 218

（三）ES和EG细胞的培养过程 218

（四）ES和EG细胞系特性和鉴定 220

三、ES细胞体外诱导分化 221

（一）ES细胞体外诱导分化的意义 221

（二）ES细胞体外诱导分化的基本原理 222

（三）ES细胞体外诱导分化的基本方法 222

（四）ES细胞体外分化的细胞类型 223

四、诱导分化细胞的永生化 225

五、小鼠骨髓和脾来源树突状细胞的分离与扩增培养 226

第三节 癌细胞分化研究 228

一、癌细胞分化研究的简况 228

二、癌细胞分化研究 228

（一）HL-60细胞分化诱导实验 228

（二）肝癌Bel 7402细胞分化诱导实验 233

（三）神经母细胞瘤LA-N-5细胞的分化诱导试验方法 234

（四）小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导实验 235

三、癌细胞分化研究几种常用的检测技术 236

（一）免疫荧光法——检测横纹肌肉瘤分化抗原myosin 236

（二）流式细胞术——检测肿瘤细胞生物分子表达的改变 237

（三）研究肿瘤细胞代谢的31PNMR谱测定 238

第十章 细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用 240

第一节 细胞凋亡的常用研究方法 240

一、细胞凋亡的形态学研究方法 240

（一）凋亡细胞的姬姆萨染色 240

（二）凋亡细胞的电子显微镜观察 241

（三）凋亡细胞的碘化丙锭（PI）排斥分析法 241

（四）双苯并咪唑染料（Ho）活细胞吸收分析法 242

（五）凋亡细胞对胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶敏感性分析法 243

二、细胞凋亡的生物化学研究方法 243

（一）超速离心法 243

（二）琼脂糖凝胶电泳法 244

（三）末端标记电泳法 245

三、细胞凋亡的免疫化学分析方法 247

四、细胞凋亡的分子生物学研究方法 249

（一）TUNEL法 249

（二）缺口翻译法 250

五、细胞凋亡时Ca2+浓度测定 252

第二节 抗凋亡研究 253

一、bcl-2基因的抗凋亡作用 253

二、细胞抗凋亡的信号转导通路 254

第三节 细胞衰老的常用研究方法 255

一、端粒长度的测定 256

二、错配修复基因的测定 257

三、微卫星不稳定性的测定 258

第十一章 细胞融合与单克隆抗体制备 260

第一节 单克隆抗体制备的基本原理 261

第二节 小鼠-小鼠B淋巴细胞杂交瘤 263

一、融合用细胞的制备 263

二、细胞融合 267

三、杂交瘤细胞的选择培养 268

四、特异抗体的检测 269

五、杂交瘤细胞的克隆化 272

六、杂交瘤细胞的冻存 273

七、单克隆抗体的大量制备 274

八、单克隆抗体Ig类型的鉴定 274

九、小鼠单克隆抗体的纯化 275

第三节 人-人淋巴细胞杂交瘤与人-鼠杂交瘤细胞 277

一、人-人淋巴细胞杂交瘤技术 277

二、人-小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术 279

第四节 大鼠-大鼠B淋巴细胞杂交瘤 279

一、大鼠骨髓瘤细胞系 280

二、大鼠B淋巴细胞的制备 280

三、细胞融合 280

四、大鼠单克隆抗体的生产 280

五、大鼠单克隆抗体的提纯 280

第五节 基因工程抗体 281

一、人-鼠嵌合抗体（human-mouse chimericantibodies） 281

二、小分子抗体 282

三、双特异性抗体 283

四、噬菌体抗体 283

第十二章 细胞培养的应用 285

第一节 细胞培养在分子生物学中应用 285

一、分离提取研究 285

二、基因导入 291

三、原位检测研究 296

第二节 细胞培养在生物工程中的应用 298

一、大规模细胞培养的体系参数 300

二、大规模细胞培养的工艺类型 300

三、大规模细胞培养方法 301

第三节 细胞培养在生物制品中的应用 305

一、生物制品的概念 305

二、细胞培养在疫苗制备中的应用 305

第四节 细胞培养在药物开发中的应用 307

第五节 细胞培养在临床中的应用 316

一、细胞培养在临床诊断中的应用 316

二、细胞培养在临床治疗中的应用 318

附录Ⅰ实验室常用的细胞系株 324

附录Ⅱ-1常用缓冲液 327

附录Ⅱ-2其他缓冲液的配制 328

附录Ⅲ常用人工合成细胞培养基 330

索引 331