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理论部分 3

1 绪论 3

1.1 生物化学实验技术发展简史 3

目录 3

1.2 实验室规则 6

1.3 实验室安全及防护知识 7

1.3.1 着火 7

1.3.2 爆炸 8

1.3.3 中毒 8

1.3.4 外伤 9

1.3.5 触电 9

1.4 实验记录与实验报告 10

1.4.1 实验记录 10

1.4.2 实验报告 10

1.5.1 玻璃仪器的清洗 11

1.5 实验室基本操作 11

1.5.2 塑料器皿的清洗 12

1.5.3 洗液的配制 12

1.5.4 其他洗涤液 12

1.5.5 玻璃和塑料器皿的干燥 12

1.5.6 移液 13

1.6 缓冲溶液与pH值测定 16

1.6.1 基本概念 16

1.6.2 生物化学常用缓冲液 18

1.6.3 pH值的测定 19

1.7 生物化学实验室的基本设施与装备 22

1.7.1 温度与环境设施 22

1.7.2 实验室用纯水 22

1.7.7 层析装置 23

1.7.6 电泳装置 23

1.7.3 消毒系统 23

1.7.4 计量系统 23

1.7.5 离心设备 23

1.7.8 光密度仪 24

1.7.9 真空印迹系统 24

1.7.10 核酸自动合成仪与测序仪 24

1.7.11 蛋白质的自动合成与测序仪 24

1.7.12 PCR仪 24

1.7.13 核素实验设施 24

1.7.14 生物培养设施 24

1.7.17 暗室 25

1.7.18 冷室 25

1.7.19 其他设备 25

1.7.16 高效液相色谱仪和毛细管电泳仪 25

1.7.15 基因导入仪 25

思考题 26

2 生物大分子的制备 27

2.1 概述 27

2.2 生物大分子制备的前处理 28

2.2.1 生物材料的选择 28

2.2.2 细胞的破碎 29

2.2.3 生物大分子的提取 30

2.3 生物大分子的分离纯化 32

2.3.1 沉淀法 32

2.3.2 透析 37

2.3.3 超滤 38

2.3.4 冰冻干燥 40

2.3.5 样品的保存 41

2.3.6 分离纯化方法的选择 43

思考题 44

3 层析技术 45

3.1 层析技术概述 45

3.1.1 引言 45

3.1.2 层析的基本理论 45

3.1.3 层析的基本概念 46

3.1.4 层析法的分类 50

3.1.5 柱层析的基本装置及基本操作 51

3.2 凝胶层析 54

3.2.1 简介 54

3.2.2 凝胶层析的基本原理 54

3.2.3 凝胶层析的基本概念 54

3.2.4 凝胶的种类和性质 57

3.2.5 凝胶的选择、处理和保存 59

3.2.6 凝胶层析的基本操作 60

3.2.7 凝胶层析的应用 62

3.3 离子交换层析 63

3.3.1 简介 63

3.3.2 基本原理 63

3.3.3 离子交换剂的种类和性质 64

3.3.4 离子交换剂的选择、处理和保存 66

3.3.5 离子交换层析的基本操作 67

3.3.6 离子交换层析的应用 68

3.4 亲和层析 69

3.4.1 简介 69

3.4.2 亲和层析的基本原理 69

3.4.3 亲和吸附剂 70

3.4.4 亲和层析的基本操作 75

3.4.5 亲和层析的应用 76

思考题 79

4 电泳技术 80

4.1 电泳技术发展简史 80

4.2 电泳的基本原理 80

4.3 影响电泳分离的主要因素 82

4.4 电泳的分类 83

4.5 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳 84

4.6 琼脂糖凝胶电泳 85

4.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 86

4.8 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 88

4.9 梯度凝胶电泳 91

4.10 等电聚焦 91

4.11 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 93

4.12 蛋白质的检测、鉴定及回收 93

4.13 蛋白质印迹 94

4.14 毛细管电泳 96

思考题 99

5 离心技术 100

5.1 基本原理 100

5.2 离心机的主要构造和类型 101

5.3 制备性超速离心的分离方法 104

5.4 离心机操作的注意事项 106

思考题 106

6 分光光度技术 107

6.1 基本原理 107

6.2 分光光度计的组成和构造 111

6.3 分光光度法在生物化学实验技术中的应用 116

思考题 116

7.1 免疫化学技术简介 117

7.2 抗原的免疫原性和专一性 117

7 免疫化学技术 117

7.3 抗体的结构和功能 118

7.4 抗原抗体的结合 120

7.5 动物的常规免疫 122

7.6 双向免疫扩散及免疫电泳 123

7.7 酶联免疫吸附法 125

思考题 127

实验部分 131

实验1 蛋白质含量测定法 131

1．微量凯氏定氮法 131

2．双缩脲法 132

3．Folin－酚试剂法 133

4．改良的简易Folin－酚试剂法 136

5．考马斯亮蓝法 136

6．紫外吸收法 138

思考题 140

实验2 凝胶层析法测定蛋白质分子质量 142

1．实验目的 142

2．实验原理 142

3．器材与试剂 143

4．实验操作 143

思考题 145

实验3 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 146

1．实验目的 146

2．实验原理 146

3．仪器和用具 147

4．试剂 147

5．溶液配制 148

6．操作步骤 148

7．数据处理 149

思考题 150

实验4 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 151

1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制 152

2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 153

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 155

4．干胶 156

5．测量并计算相对分子质量 156

思考题 157

实验5 小牛胸腺DNA的制备 158

1．实验目的 158

2．实验原理 158

3．器材与试剂 159

4．实验步骤 159

思考题 160

2．实验原理 161

实验6 小牛胸腺DNA熔解温度的测量 161

1．实验目的 161

3．器材与试剂 162

4．操作步骤 162

思考题 163

实验7 脱辅基血红蛋白的制备和重组 164

1．实验目的 164

2．实验原理 164

3．实验方法 164

思考题 166

实验8 离子交换柱层析分离核苷酸 167

1．实验目的 167

2．实验原理 167

3．试剂与器材 170

4．操作步骤 171

5．结果处理 173

思考题 174

实验9 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 175

1．蔗糖酶的提取与部分纯化 176

2．离子交换柱层析纯化蔗糖酶 177

3．蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 179

4．反应时间对产物形成的影响 183

5．pH值对蔗糖酶活性的影响 184

6．温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 185

7．底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 187

8．尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 189

9．棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 191

思考题 193

2．实验原理 194

1．实验目的 194

实验10 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 194

3．器材与试剂 195

4．实验步骤 195

5．注意事项 197

思考题 197

实验11 亲和层析纯化胰蛋白酶 198

1．引言 198

2．实验目的与要求 198

3．基本原理 198

4．试剂与器材 199

5．实验操作步骤 200

6．实验结果处理 203

7．参考资料 204

思考题 205

1．实验原理 206

实验12 兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定 206

2．实验试剂 207

3．实验步骤 207

思考题 211

实验13 免疫化学实验 212

1．免疫血清的制备 212

2．沉淀反应定量法 213

3．双向免疫扩散法 214

4．对流免疫电泳法 215

5．微量免疫电泳法 216

6．单向定量免疫电泳法（火箭电泳法） 217

7．双向免疫电泳法（交叉免疫电泳法） 219

8．酶联免疫吸附测定（ELISA） 219

9．蛋白质印迹 225

思考题 227

实验14 “干实验”：微机模拟蛋白质纯化实验 228

思考题 230

附录 231

1．722型分光光度计操作规程 231

2．753型（53W）紫外／可见分光光度计操作规程 231

3．美国UNICO7202B型可见分光光度计 232

4．恒流泵操作规程 232

5．自动部分收集器操作规程 233

6．电导率仪使用说明 233

7．日立高速冷冻离心机操作程序 233

8．各种仪器的使用注意事项 235

9．德国耶拿（蔡司）SPECORD-200和SPEKOL-1100使用说明 238

SPECORD-200使用说明 238

SPEKOL-1100使用说明 245

参考文献 247