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目录 1

第一章蛋白质的分离纯化 1

第一节蛋白质分离纯化的一般原则 1

一、蛋白质分离纯化技术及其依据 1

二、蛋白质纯化的一般设计原则 2

第二节蛋白质的层析分离 2

一、层析技术的发展简史及科学意义 2

二、层析技术的基本原理 3

三、离子交换层析 5

四、凝胶过滤层析 9

五、亲和层析 11

六、其它层析技术 14

第三节 蛋白质的电泳分离 15

一、电泳发展简史及科学意义 16

二、电泳技术的基本原理 16

三、电泳技术的分类 17

四、聚丙烯酰胺凝胶电泳概述 17

五、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 19

六、等电聚焦电泳 22

七、毛细管电泳 25

第四节蛋白质的浓缩 25

一、超滤法 25

二、冷冻干燥法 26

三、吸收法 26

四、沉淀法 26

——血清白蛋白、γ－球蛋白的分离纯化及鉴定 28

第五节蛋白质纯化及鉴定的教学实验举例 28

第二章蛋白质的定性定量分析 33

第一节蛋白质的含量测定 33

一、凯氏定氮法 33

二、Lowry法 34

三、紫外光谱吸收法 36

四、考马斯亮蓝G-250染色法 37

五、二喹啉甲酸检测法 38

一、SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子量 39

第二节 蛋白质相对分子量的测定 39

二、凝胶过滤层析法测定蛋白质相对分子量 40

第三节等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 42

一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理 42

二、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作 42

第四节其它蛋白质定性定量分析技术 44

一、蛋白质的电泳染色定量 44

二、免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量 44

三、其它测定特定蛋白质含量的方法 52

第三章蛋白质一级结构的测定 53

第一节蛋白质一级结构测定的历史及测定策略 53

一、蛋白质一级结构测定的历史 53

二、蛋白质一级结构的测定策略 54

第二节蛋白质的氨基酸组成分析 54

一、水解 54

二、衍生 54

第三节多肽链的末端分析 55

三、分离及检测 55

一、N端分析 56

二、C端分析 56

第四节肽段的氨基酸序列分析 56

一、肽链降解成肽段 56

二、肽段一级的结构测定 57

第五节二硫键、酰胺基、磷酸化及糖基化修饰定位 59

一、蛋白质分子中二硫键的定位 59

二、酰胺基及其它修饰氨基酸残基的定位 60

第四章蛋白质的空间结构分析 61

第一节蛋白质的二级结构分析 61

一、圆二色光谱法 62

二、傅里叶变换红外光谱法 63

第二节X线衍射法分析蛋白质的晶体空间结构 63

一、基本原理 64

二、晶体结构解析过程 64

第三节 核磁共振技术分析蛋白质的液相空间结构 66

一、基本原理 67

二、主要方法 69

三、蛋白质空间结构的测定 72

第四节 蛋白质空间结构的预则 75

第五节蛋白质空间结构的预测工具简介 75

第五章DNA体外重组技术 80

第一节DNA体外重组载体的种类和选择 80

一、载体的分类 81

二、不同载体的特点和分类 81

二、DNA聚合酶 84

第二节基因工程中常用的工具酶 84

一、限制性核酸内切酶 84

三、DNA连接酶 85

四、其它DNA修饰酶 85

第三节 目的基因的获得和修饰 85

一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因 85

二、采用PCR或RT-PCR方法制备目的基因 86

三、基因组文库或cDNA文库的构建和筛选 86

一、PCR产物的克隆策略 87

四、化学合成法制备基因片段 87

第四节 目的基因和载体的连接 87

二、外源DNA片段和载体的连接 88

第五节重组分子的扩增和鉴定 88

一、重组DNA分子导入受体细胞 88

二、重组DNA分子的鉴定 89

第六节基因体外重组实验举例 90

第六章核酸分子杂交 94

第一节核酸探针及其标记 94

一、核酸标记物及其选择 94

二、核酸探针的标记方法 96

三、标记探针的纯化 100

第二节核酸分子杂交的种类和方法 101

一、固相支持物与印迹方法的选择 101

二、Southern印迹杂交 103

三、Northern杂交 106

五、原位杂交 109

四、斑点杂交与狭缝杂交 109

第七章聚合酶链反应（PCR）技术 111

第一节 PCR的反应体系 112

一、寡核苷酸引物 112

二、缓冲液 112

三、DNA聚合酶 112

四、脱氧核苷三磷酸 113

五、模板DNA 114

第二节PCR引物的设计 114

第三节PCR的基本操作步骤及条件优化 115

一、基本操作步骤 115

二、条件优化 115

第四节PCR衍生技术 117

第五节PCR技术的应用 123

一、基因分析 123

一、RT-PCR 125

第六节PCR实验举例 125

二、定位克隆 125

三、序列分析 125

二、重组PCR 126

第八章DNA序列分析技术 129

第一节DNA序列测定的原理和技术 129

一、DNA测序原理 129

二、DNA测序策略 130

三、DNA测序的常用技术 131

一、自动激光荧光DNA测序原理 132

第二节全自动激光荧光DNA测序 132

二、自动激光荧光DNA测序注意事项 133

三、自动激光荧光DNA测序程序 134

第九章外源基因的原核表达 139

第一节原核表达系统常用的载体及其应用 139

一、大肠杆菌表达系统 139

二、芽孢杆菌表达系统 141

三、链霉菌表达系统 142

一、蛋白质在原核细胞中的表达特点 143

第二节外源基因的表达和鉴定 143

二、包含体的形成、变性与复性 144

三、蛋白质在原核细胞中表达的调控 145

四、外源基因在原核细胞中表达的鉴定 146

第三节 外源基因表达条件的优化 147

一、表达载体的优化设计与选择 147

二、增加mRNA的稳定性 148

三、提高外源蛋白的稳定性 148

四、工程化宿主菌的选择 149

第四节 外源基因原核表达的基本操作方法与步骤 149

一、获得目的基因并克隆入原核表达载体 150

二、rhTNFa工程菌的建立 150

三、rhTNFa的表达和鉴定 151

四、rhTNFa样品的鉴定 151

第一节概述 153

一、真核细胞表达宿主的种类及各自优势 153

第十章外源基因在真核细胞中的表达 153

二、真核细胞表达外源基因的意义 154

三、外源基因导入真核细胞的基本方法 154

四、外源基因在真核细胞中表达的主要方式 154

五、外源基因在真核细胞中表达产物的鉴定和纯化 155

第二节 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 155

一、哺乳动物细胞表达载体 155

二、常用的哺乳动物细胞的种类 161

三、哺乳动物细胞的基因导入方法 162

第三节 外源基因在酵母细胞中的表达 164

一、酵母细胞表达载体 164

二、酵母细胞培养的基本技术及外源基因的导入方法 166

第四节 外源基因在昆虫细胞中的表达 168

一、用于昆虫细胞蛋白表达的载体或载体系统 168

二、常用的昆虫细胞株 170

三、杆状病毒进行蛋白质表达的程序 170

二、基因体外转录的基本原理 173

一、基因体外转录的目的和意义 173

第一节基因的体外转录 173

第十一章基因的体外转录和翻译 173

三、基因体外转录的基本实验流程 174

第二节 基因的体外翻译 177

一、基因体外翻译的目的和意义 177

二、基因体外翻译的基本原理 177

三、基因体外翻译的基本实验流程 178

四、基因体外翻译实验中常遇到的问题 180

五、基因体外翻译方法的选择 181

第十二章基因文库 182

第一节基因组DNA文库 182

一、基因组DNA文库的概念及应用 182

二、基因组DNA文库的完整性与代表性 182

三、构建基因组DNA文库的载体系统 183

四、基因组DNA文库的构建 184

五、基因组DNA文库的筛选 187

一、概述 190

第二节 cDNA文库 190

二、cDNA文库的构建 191

三、cDNA文库的筛选 197

第十三章遗传修饰动物模型 199

第一节转基因动物的概念及其发展简史 199

第二节研制转基因动物的基本步骤 199

一、转基因载体的构建及制备 199

二、转基因方法 200

三、转基因动物的检测 201

第三节建立基因打靶动物模型的策略 202

一、研制基因打靶小鼠的策略 204

二、ES细胞相关操作技术 209

三、基因打靶小鼠的研究实例-Smad5基因剔除小鼠的建立和鉴定 210

第四节遗传修饰动物模型在生物医学研究中的应用前景 214

第十四章生物芯片技术 216

第一节概述 216

一、生物芯片的概念 216

二、DNA芯片 217

一、原位合成DNA芯片的制作 218

第二节生物芯片的制作 218

二、DNA微集阵列芯片的制作 219

第三节DNA芯片使用的基本流程 221

一、待测样品的准备 221

二、分子杂交反应 222

三、检测分析 222

第四节蛋白质芯片 223

一、DNA芯片与基因表达谱研究 224

第五节 生物芯片的基本操作及应用 224

二、DNA测序 229

三、基因突变检测 230

四、基因诊断 231

五、蛋白质芯片的应用 233

六、药物研发 233

第十五章人类基因组学相关技术 235

第一节 人类基因组计划的主要研究内容及进展 235

一、遗传图谱 235

二、物理图谱 236

四、转录图谱 237

三、序列图谱 237

第二节 人类基因组计划在医学中的意义 238

一、基因结构与功能的研究 238

二、基因组信息与疾病易感性的研究 238

三、基因组与癌症研究 239

四、疾病的遗传学背景 239

五、药物基因组学 240

二、NCBI基因组数据库的应用 241

第三节 人类基因组计划数据的利用 241

一、主要相关数据库 241

三、利用基因组数据信息发现新基因 244

四、其它检索系统 244

第十六章蛋白质组学研究技术 246

第一节概述 246

一、蛋白质组学的产生 246

二、蛋白质组学的概念 246

三、蛋白质组学研究的意义 247

第二节蛋白质组学研究的技术体系 248

一、双向电泳 249

二、生物质谱与蛋白质鉴定 253

三、翻译后修饰蛋白质的鉴定 257

四、蛋白质组数据库 260

第三节蛋白质组学的应用 262

第一节概述 263

一、研究差异表达基因的目的和意义 263

第十七章研究差异表达基因的相关技术 263

二、研究差异表达基因的主要方法 264

第二节 基于PCR的消减杂交技术 269

一、基本原理 269

二、实验流程 269

三、实验方法 271

四、结果与分析 273

五、对所获基因作进一步研究的思路 276

六、方法学讨论和注意事项 276

一、酵母双杂交系统的建立和基本原理 278

第十八章用酵母双杂交系统研究蛋白质－蛋白质相互作用 278

第一节酵母双杂交系统简介 278

二、酵母双杂交系统的基本策略 280

三、酵母双杂交系统的优点 280

四、酵母双杂交技术的应用现状 280

五、酵母双杂交系统中常见问题的解决与改进措施 281

六、酵母双杂交系统使用注意事项 282

七、逆双杂交系统和三杂交技术 283

二、实验流程 284

三、实验方法 284

一、基本材料和试剂 284

第二节酵母双杂交的实验过程 284

第三节酵母双杂交实验实例结果和讨论 289

第十九章新基因功能研究的策略 294

第一节 从蛋白质产物功能和基因表达规律研究基因的功能 294

第二节抑制基因表达或除去基因 298

附录一分子生物学实验常用参数 300

附录二常用试剂的配制 308