真核生物转录调控 概念、策略与技术PDF电子书下载

1 哺乳动物细胞转录调控入门 1

引言和概述 1

全基因组方法小结 3

染色质和通用转录机器 5

染色质结构和组织 5

染色质修饰 8

染色质重塑 12

通用转录机器 17

调控区的组织 18

基础转录复合物的组装和起始 25

调解因子 28

TFIID和TAF 29

活化和抑制 31

基因活化 31

转录起始期间的染色质修饰和重塑 32

通用机器募集的一种模式 34

聚合酶Ⅱ延伸的初始阶段 35

聚合酶Ⅱ在基因内遭遇核小体 37

转录的沉默或抑制 39

结语 45

参考文献 46

2 初始策略性问题 55

引言和概述 55

实验策略 56

新转录因子的表征方法 56

分析新基因的调控 60

专题2.1 核连缀转录分析 63

考虑达到明确目标所需的时间投入和资源 64

确定项目目标 65

评估分析的可行性 66

启动对新基因的综合转录调控分析 68

技术 70

方案2.1 核连缀分析 70

参考文献 77

3 转录起始位点的定位 79

引言和概述 79

实验策略 82

初步考虑 82

快速扩增cDNA末端（RACE） 84

专题3.1 帽子依赖性RACE程序 85

引物延伸 87

专题3.2 引物延伸 87

RNase保护法 91

专题3.3 RNase保护 92

S1核酸酶分析 94

专题3.4 核酸酶保护 95

专题3.5 内含子对起始位点定位结果解释的影响 96

技术 98

方案3.1 引物延伸分析 98

方案3.2 RNase保护分析 106

参考文献 113

4 启动子分析的功能性分析方法 116

引言和概述 116

实验策略 119

选择分析方法：各种分析方法的优缺点 119

瞬时转染分析 127

专题4.1 常用的转染方法 128

专题4.2 萤光素酶报告基因分析 130

专题4.3 CAT报告基因分析 131

专题4.4 LacZ、SEAP和GFP报告基因分析法 133

专题4.5 瞬时转染细胞的分离 134

通过染色体整合的稳定转染分析 139

专题4.6 有复制能力的载体 141

技术 147

哺乳动物细胞的常用转染方法 147

方案4.1 3T3成纤维细胞的磷酸钙转染 148

方案4.2 淋巴细胞系的DEAE－葡聚糖转染 150

方案4.3 RAW264.7巨噬细胞的电穿孔转染 152

方案4.1～4.3 的附加说明 155

方案4.4 萤光素酶分析 156

方案4.5 氯霉素乙酰转移酶分析 158

方案4.6 β-半乳糖苷酶分析 161

参考文献 163

5 远程控制区的鉴定和分析 169

引言和概述 169

专题5.1 DNase Ⅰ高敏感性分析 173

实验策略 176

DNaseⅠ高敏感性 176

基质附着区的鉴定 180

专题5.2 鉴定MAR的方法 180

鉴定远程控制区的功能性方法 182

表征远程控制区的功能性分析方法 187

参考文献 191

6 鉴定控制区内的顺式作用DNA元件 197

引言和概述 197

实验策略 199

通过综合性突变体分析鉴定控制元件 199

综合性分析的策略 200

来自综合性突变体分析与系统发生分析比较的深刻见解 213

参考文献 215

7 鉴定DNA结合蛋白及其基因 217

引言和概述 217

鉴定DNA结合蛋白的实验策略 219

数据库方法 219

用于粗制细胞裂解物的蛋白质-DNA相互作用分析方法的发展 222

专题7.1 假设EMSA结果 229

克隆和鉴定编码DNA结合蛋白基因的实验策略 236

专题7.2 通过蛋白质纯化克隆 237

通过蛋白质纯化和肽序列分析进行克隆 239

其他克隆方法 242

参考文献 246

8 确认蛋白质-DNA相互作用的功能相关性 249

引言和概述 249

实验策略 252

染色质免疫沉淀 252

通过基因破坏或RNA干扰的功能缺失研究 254

体外蛋白质－DNA复合物的丰度 257

DNA结合蛋白和靶基因的相对表达模式 258

蛋白质结合所需核苷酸和调控元件活性所需核苷酸之间的相关性 260

DNA结合蛋白的过量表达对报告基因或内源基因的反式激活 261

与相邻控制元件结合的蛋白质间的协作结合和协同效应 262

基因组足迹模式和体外足迹模式的比较 264

蛋白质－DNA相互作用的相对亲和力 265

显性失活突变体 267

体外转录策略 270

改变特异性实验 272

参考文献 274

9 内源性控制区的体内分析 279

引言和概述 280

实验策略 281

染色质免疫沉淀 281

DamID 283

DNaseⅠ和DMS基因组足迹 285

专题9.1 连接介导PCR 286

高锰酸钾基因组足迹 289

核小体存在和定位的Southern印迹分析 289

专题9.2 通过MNase-Southern印迹分析进行核小体定位的低分辨率分析 291

监测核小体存在和定位的LM-PCR、PCR及ChIP策略 292

用于分析核小体重塑的体内方法的概述 295

DNaseⅠ高敏感性监测核小体重塑 295

用于监测核小体重塑的MNase方法 296

限制性内切核酸酶可及性分析 297

专题9.3 限制性内切核酸酶可及性－LM-PCR分析 300

染色质构象捕获 303

DNA甲基化 305

技术 306

方案9.1 MNase-Southern印迹分析 306

方案9.2 LM-PCR方法 316

方案9.3 染色质免疫沉淀 333

参考文献 340

10 鉴定和表征转录调控因子的结构域 348

引言和概述 349

实验策略：定义结构域 349

功能结构域的鉴定 349

专题10.1 结构域的计算分析 350

基本突变原理 352

专题10.2 表达系统 352

专题10.3 标签识别与检测的通用方法 355

序列特异性调控因子的结构域 359

分离序列特异性调控因子的DNA结合和激活／抑制结构域 360

专题10.4 VP16激活结构域：个案研究 363

专题10.5 GAL4：个案研究 364

专题10.6 KRAB抑制结构域：个案研究 366

细分DNA识别亚结构域和寡聚化亚结构域 369

概念和策略：蛋白质－蛋白质相互作用 370

共激活因子和共抑制因子的分离及克隆 370

研究激活结构域与共激活因子相互作用的方法 371

通过亲和层析研究激活／抑制结构域与其靶标之间的相互作用 372

改变特异性遗传系统 374

通用转录机器的结构－功能分析 377

共激活因子的分析 379

技术 383

方案10.1 PCR介导的定点突变 383

参考文献 389

11 DNA的调控性转录因子结合 398

引言和概述 398

实验策略 401

DNA－蛋白质相互作用的一般理论和实例 401

专题11.1 Kd情况的例子 413

DNA－蛋白质相互作用的分析及建模 415

专题11.2 SAAB分析 418

专题11.3 DNaseⅠ足迹和外切核酸酶足迹 420

专题11.4 用于小沟相互作用的化学探针 423

启动子特异性多组分核蛋白复合物的分析 432

技术 439

方案11.1 DNase Ⅰ足迹 439

方案11.2 羟自由基足迹 448

方案11.3 磷酸乙基化干扰分析 452

方案11.4 甲基化干扰分析 455

方案11.5 电泳迁移率变动分析 461

方案11.6 32P末端标记DNA片段的准备 465

参考文献 470

12 体外转录和起始前复合物组装 477

引言和概述 478

实验策略 481

提取物的制备 481

转录分析 484

专题12.1 测定体外转录的方法 485

分级分离的系统 490

专题12.2 纯化的转录因子 493

基本起始前复合物的形成 496

开放复合物的形成、起始和启动子逃脱 508

活化复合物在启动子上的组装 513

技术 521

核提取物制备：概述 521

方案12.1 Dignam和Roeder核提取物 522

方案12.2 使用HeLa细胞提取物和引物延伸的体外转录 526

方案12.3 使用HeLa细胞核提取物的无G序列盒体外转录 533

共激活因子的纯化（方案12.4和方案12.5） 537

方案12.4 表位标记TFIID的纯化 537

方案12.5 从表达FLAG标记调解因子亚基的HeLa细胞系中纯化调解因子 543

方案12.6 固定化模板分析 547

方案12.7 Pol Ⅱ开放复合物的高锰酸钾探测 556

方案12.8 DNA结合TFIID的镁－琼脂糖EMSA 561

参考文献 566

13 体外研究染色质动力学：染色质组装、重塑和转录 588

引言和概述 588

实验策略 589

用于组装染色质的策略 589

专题13.1 DNA模板和重建方法对阵列内核小体定位的影响 592

组蛋白来源 595

染色质重建的生化表征 598

专题13.2 核小体阵列的MNase分析 603

专题13.3 核小体阵列的EcoRI酶切分析 605

体外测验组蛋白修饰作用策略 606

染色质重塑／修饰酶的分析 610

以染色质模板进行体外转录 619

技术 621

方案13.1 鸡红细胞组蛋白八聚体制备 621

方案13.2 核小体的盐梯度透析重建 632

方案13.3 利用重组的果蝇ACF和NAP1重建核小体阵列 637

参考文献 650

附录：注意事项 659

索引 668