同济博士论丛 拟南芥中RNA指导的DNA甲基化PDF电子书下载

第1章 绪论 1

1.1 RNA指导的DNA甲基化 1

1.2 siRNA的产生 1

1.3 DNA甲基转移酶 4

1.3.1 MET1 4

1.3.2 CMT3 4

1.3.3 重新甲基化酶DRM及不对称甲基化 6

1.3.4 DNA甲基化复合体 7

第2章 材料与方法 12

2.1 实验材料 12

2.2 方法 13

2.2.1 植物总DNA的提取（CTAB法） 13

2.2.2 植物总RNA提取（RNeasy Plant Mini Kit,QIAGEN） 13

2.2.3 cDNA合成（SuperScript.Ⅲ First-Strand Synthesis System,Invitrogen） 14

2.2.4 感受态的制备与转化 15

2.2.5 DNA的回收（离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒QIAGEN） 17

2.2.6 RNA分析 18

2.2.7 DNA甲基化分析 19

2.2.8 6xHis-tagged蛋白质纯化（Ni-NTA Fast Start Kit,QIAGEN） 19

2.2.9 位点突变（QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit,Stratagene） 20

2.2.10 凝胶阻滞分析（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA） 22

2.2.11 免疫共沉淀 24

2.2.12 免疫荧光法和显微镜 25

2.2.13 植物染色体蛋白的免疫染色 27

2.2.14 染色质免疫沉淀 28

第3章 结果与分析 32

3.1 通过筛选ros1的抑制子，确定了RDM1是转录基因沉默途径中的一个新成员 32

3.1.1 ROS1：植物中去甲基化酶的发现 32

3.1.2 在ros1突变体背景下，rdm1突变体抑制了转基因以及其内源基因的转录基因沉默 34

3.1.3 rdm1-1突变体阻止了RD29A启动子24 nt siRNAs的产生以及抑制了启动子的超甲基化 37

3.1.4 rdm1突变体减少了siRNAs的产生，提高了RdDM途径内源基因的表达水平 39

3.1.5 rdm1突变体减少了RdDM途径内源基因的非CG甲基化水平 41

3.2 RDM1基因的分离和功能分析 45

3.2.1 RDM1编码一个小的核蛋白 45

3.2.2 RDM1结合单链甲基化的DNA 49

3.3 RDM1是RdDM受体复合体蛋白中的一个组成部分 53

3.3.1 RDM1与AGO4，Pol Ⅱ和DRM2相关联 53

3.3.2 RDM1与AGO4，Pol Ⅱ和DRM2共定位 55

第4章 RDM3和RDM4 61

4.1 通过筛选ros1的抑制子，确定了RDM3，RDM4是转录基因沉默途径中的另外两个新成员 61

4.2 RDM3与AGO4，NRPE1相关联，共定位 65

4.3 RDM4与Pol Ⅱ，Pol Ⅴ相关联，共定位 66

第5章 结论与讨论 69

5.1 rdm1突变体对于重新甲基化和siRNAs的影响 69

5.2 RDM1是RdDM受体复合物中的一员及其可能的功能模式 70

5.3 RDM3和RDM4 72

参考文献 73

附录A RDM1的同源二聚体和rdm1-4突变体的特性 84

附录B DNA探针和引物 87

附录C 彩图 91

后记 97