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第一章 绪论 1

第一节 基因工程的诞生 1

一、基因及基因工程的含义 1

二、基因工程诞生的理论基础 2

三、基因工程诞生的技术突破 2

四、基因工程的诞生与发展 3

五、基因工程的主要操作内容和基本技术路线 5

第二节 基因工程的安全性及其管理 5

一、基因工程对人类健康安全性的影响 6

二、基因工程对环境安全性的影响 6

三、基因工程引发的伦理道德问题 7

四、基因工程安全性评价与管理 8

第三节 基因工程的应用 11

一、基因工程在农业中的应用 11

二、基因工程在工业中的应用 13

三、基因工程在医药中的应用 14

四、基因工程在环境保护中的应用 19

第二章 基因工程的主要技术原理 21

第一节 DNA的提取与纯化 21

一、质粒DNA的提取 21

二、基因组DNA的提取 23

三、 DNA的定量和纯度测定 24

四、DNA相对分子质量的估计 24

第二节 DNA的凝胶电泳 24

一、电泳的基本原理 24

二、琼脂糖凝胶电泳 24

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 25

第三节 核酸和蛋白质的分子杂交 28

一、Southern杂交 28

二、Northern杂交 28

三、Western杂交 30

四、原位杂交 31

五、菌落杂交 33

第四节 PCR技术及应用 33

一、PCR及其发明 33

二、PCR技术的原理 34

三、PCR的温度循环过程 35

四、PCR的特点 35

五、影响PCR扩增的因素 36

六、PCR技术的扩展 38

七、PCR技术的应用 45

第五节 DNA序列分析 48

一、双脱氧链终止法 48

二、Maxam-Gilbert化学降解法 51

三、DNA杂交测序 53

四、DNA自动化测序 54

五、第二代测序技术 55

六、第三代测序技术 57

第六节 DNA与蛋白质相互作用分析 58

一、凝胶阻滞试验 58

二、DNase足迹试验 58

三、染色体免疫沉淀技术 59

四、酵母双杂交系统 59

五、酵母单杂交系统 61

第七节 RNA干扰技术 64

一、RNAi作用机制 64

二、RNAi机制相关基因和酶 65

三、RNAi技术的应用 65

四、RNAi技术要点 66

第三章 基因工程的酶学基础 69

第一节 限制性内切核酸酶 69

一、限制性内切核酸酶的基本概念和生物学功能 69

二、限制性内切核酸酶的命名 70

三、限制性内切核酸酶的分类 71

四、限制性内切核酸酶产生的末端 72

五、影响限制性内切核酸酶酶切反应的因素 73

第二节 DNA连接酶 77

一、DNA连接酶的基本性质和特点 77

二、DNA连接酶的类型 77

三、 DNA连接酶的连接反应机制 77

四、DNA连接酶的连接反应条件 78

五、影响DNA连接酶连接反应的因素 78

第三节 DNA聚合酶 79

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 79

二、K l enow片段 80

三、T4DNA聚合酶 81

四、T7DNA聚合酶 81

五、修饰后的T7DNA聚合酶 82

六、反转录酶 82

第四节 DNA修饰酶 82

一、末端脱氧核苷酸转移酶 82

二、T4多核苷酸激酶 84

三、碱性磷酸酶 84

第五节 外切核酸酶 84

一、单链DNA外切酶 85

二、双链DNA外切酶 85

第六节 单链DNA内切酶 85

一、S1单链核酸酶 85

二、Bal 31核酸酶 86

第四章 基因工程载体 88

第一节 质粒载体 88

一、质粒 88

二、质粒载体 90

三、经典的大肠杆菌质粒载体 93

四、其他质粒载体 97

五、质粒载体的稳定性 98

第二节 噬菌体载体 98

一、噬菌体的一般特性 98

二、噬菌体的生活周期 99

三、单链噬菌体载体 99

四、双链噬菌体载体——λ载体 107

第三节 大分子DNA克隆载体 113

一、酵母人工染色体 113

二、细菌人工染色体 115

、人类人工染色体 117

四、植物人工染色体 118

第四节 病毒载体 119

一、CaMV载体 119

二、SV40病毒载体 120

三、腺病毒载体 121

四、反转录病毒载体 122

第五节 RNAi载体 124

一、VIGS载体 125

二、hpRNA表达载体 126

第五章 目的基因的获取 131

第一节 化学合成法 131

第二节 直接分离法 134

第三节 体外扩增法 135

第四节 文库构建法 136

一、基因文库的构建 136

二、cDNA文库的构建 138

第五节 基于差异表达分离目的基因 139

一、mRNA差异显示PCR 139

二、消减杂交 140

三、cDNA代表性差异分析技术 140

四、抑制性消减杂交技术 142

第六章 基因的体外重组和转移 144

第一节 目的基因的体外重组 144

一、目的基因和载体的酶切 144

二、酶切DNA的电泳检测与回收 145

三、酶切DNA片段的体外连接 146

四、重组质粒的验证 150

第二节 重组载体导入原核生物 150

一、基因工程常用的原核生物 150

二、重组载体导入大肠杆菌 151

第三节 重组载体导入真核生物 154

一、重组载体导入酵母细胞 154

二、重组载体导入植物细胞 155

三、重组载体导入动物细胞 159

第七章 重组子克隆的筛选和鉴定 162

第一节 载体表型选择法 162

一、抗药性标记及其插入失活选择法 162

二、β-半乳糖苷酶α肽互补显色选择法 163

三、利用报道基因筛选植物转化细胞 164

四、利用遗传选择标记筛选哺乳动物转化细胞 166

第二节 插入基因表型选择法 167

一、弥补缺陷表型选择法 168

二、增加新性状表型选择法 168

第三节 DNA电泳检测法 168

一、直接电泳筛选法 168

二、限制酶酶切电泳筛选法 168

三、 PCR扩增电泳检测法 169

第四节 核酸分子杂交检测法 170

第五节 免疫化学检测法 171

一、放射性抗体检测法 171

二、免疫沉淀检测法 172

三、酶联免疫吸附测定 172

四、Western杂交检测 172

第六节 转译筛选法 173

一、转译筛选 173

二、杂交抑制转译法 173

三、杂交释放转译法 174

第八章 克隆基因的表达 175

第一节 外源基因在原核细胞中的表达 175

一、原核生物基因表达的特点 175

二、原核生物基因表达调控序列 176

三、几种类型的原核表达系统 177

四、外源基因在原核细胞中高效表达的策略 184

第二节 外源基因在真核细胞中的表达 187

一、真核生物基因表达调控的特点 187

二、真核生物基因表达调控序列 187

三、真核表达系统 189

第九章 外源基因表达产物的分离纯化 194

第一节 重组蛋白分离纯化的原则要求 194

一、针对不同形式表达的产物采取不同的处理措施 194

二、针对重组蛋白的性质选择不同的分离技术和流程 194

三、综合运用多种分离纯化技术 195

四、选择适合的分离纯化介质 196

五、分离纯化过程的规模化 196

第二节 重组蛋白分离纯化的技术原理 196

一、层析 196

二、高效液相色谱法 204

三、气相色谱法 205

四、膜分离 205

第三节 重组蛋白分离纯化的基本流程 208

一、发酵液的预处理 208

二、菌体收集与细胞破碎 208

三、重组蛋白的粗分离 209

四、重组蛋白的精细纯化 210

第十章 大肠杆菌基因工程 214

第一节 大肠杆菌受体菌株及相关表达载体 214

一、大肠杆菌受体菌株 214

二、大肠杆菌表达载体 215

第二节 大肠杆菌中目的基因的高效表达策略 220

一、包涵体型蛋白表达策略 220

二、融合型蛋白表达策略 221

三、分泌型蛋白表达策略 222

四、寡聚型蛋白表达策略 223

五、整合型蛋白表达策略 224

第三节 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 224

一、胰岛素的结构 224

二、重组人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建 225

第四节 基因工程菌的大规模培养与遗传不稳定性 228

一、基因工程菌的大规模培养 228

二、影响基因工程菌遗传不稳定性的因素 229

三、改进基因工程菌遗传不稳定性的对策 230

第十一章 酵母基因工程 232

第一节 酵母宿主菌及改造 232

一、酵母宿主菌 232

二、酵母宿主菌的改造 234

第二节 酵母载体系统 240

一、酵母载体的一般构件 240

二、酵母载体的基本类型 241

三、酿酒酵母细胞表面展示表达载体 244

第三节 重组子在酵母中的转化、筛选与表达 245

一、重组子在酵母中的转化与筛选 245

二、重组异源蛋白在酵母中的表达与加工修饰 246

第四节 利用重组酵母生产乙肝疫苗 249

一、乙肝病毒及其结构 249

二、产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母的构建 250

三、产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母的构建 251

第十二章 高等植物基因工程 253

第一节 高等植物的遗传学特征 253

第二节 高等植物基因工程受体系统 254

一、愈伤组织受体系统 254

二、原生质体受体系统 255

三、种质受体系统 256

四、胚状体受体系统 256

五、直接分化芽受体系统 257

第三节 农杆菌Ti质粒介导的高等植物转基因技术 257

一、Ti质粒的结构与改造 258

二、农杆菌载体的构建 258

三、Ti质粒介导的整合转化的分子机制 260

第四节 高等植物的基因表达系统 261

一、外源基因的四环素诱导系统 262

二、外源基因的乙醇诱导系统 263

三、外源基因的类固醇诱导系统 264

第五节 植物转基因技术的应用 266

一、利用转基因植物生产药用蛋白 266

二、抗虫害的转基因植物 267

三、转基因黄金大米 269

四、抗除草剂转基因植物育种 270

第十三章 哺乳动物基因工程 273

第一节 哺乳动物基因工程概述 273

第二节 哺乳动物的受体系统 274

一、哺乳动物细胞的生物学特征 274

二、高效表达外源基因的哺乳动物受体细胞应具备的条件 274

三、常用的哺乳动物受体细胞 274

四、哺乳动物受体细胞的遗传标记 275

第三节 哺乳动物载体系统 276

一、质粒型载体 277

二、病毒型载体 278

三、定向打靶载体 282

第四节 哺乳动物细胞的基因导入方法 289

第五节 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白 290

一、哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本方法 290

二、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白的实例 293

主要参考文献 297

索引 299