RNA研究方法 导读版 原著第4版 英文PDF电子书下载

1重温RNA和细胞生物化学 1

为什么研究RNA？ 1

RNA是什么？ 2

多核苷酸的装配 5

RNA的种类 8

转录和中心法则 10

研究转录的重要动植物模型 11

启动子和调控元件 12

基因和基因组的组织影响转录 14

RNA聚合酶和转录产物 18

信使RNA 22

典型的mRNA分子的拓扑学 23

5＇帽 23

引导序列 25

编码区 25

尾随序列 26

多聚A尾 26

细胞器mRNA 28

mRNA的稳定性、转运和转归 29

双顺反子mRNA 30

原核mRNA 30

mRNA的序列和结构影响翻译 31

基因调控的水平 32

来自单基因座的mRNA的可变剪接 34

反式剪接：mRNA的修复 35

小RNA综观 36

微小RNA对基因表达的调控 37

参考文献 38

2分离RNA的策略 45

概述 45

纯化RNA过程中的目标 47

裂解缓冲液配方 49

温和的裂解缓冲液 49

方案：用低渗裂解分离胞质RNA 51

离液性裂解缓冲液 56

用含胍的缓冲液分离RNA 57

胍-酸-酚抽提技术 58

方案：胍-酸-酚抽提 59

密度梯度离心 60

氯化铯 61

方案：氯化铯梯度 61

三氟乙酸铯 65

方案：三氟乙酸铯梯度 65

同时分离RNA和DNA 68

方案：同时分离RNA和DNA 69

说说试剂盒 71

硅胶的技术 72

用硅胶柱分离胞质RNA 73

亲和介质 73

其他方法 74

方案：用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA 74

方案：分离原核RNA 75

方案：分离酵母RNA 76

提纯的RNA的短期和长期保存 78

参考文献 79

3关于组织的真相 81

概述 81

组织培养物还是组织？ 81

细胞培养的优点 82

组织样品的优点 83

匀浆法 84

用Polytron捣碎 84

用Dounce匀浆器匀浆 86

BeadBeaterTM技术 87

各种器官和组织的RNA分离的策略 87

新鲜组织 89

冻存组织 90

固定的组织 91

方案：分离组织RNA的LiCl-尿素法 92

方案：从富含类脂样品分离RNA 95

与聚核糖体结合的mRNA的提纯 96

方案：聚核糖体mRNA的分离 98

在野外收集样品 99

RNA“清洗”法 100

从组织分离RNA的困难解决 101

参考文献 102

4走向绿色：植物RNA及其分子生物学 105

概述 105

RNA的分离和植物的怪异点 105

植物细胞产生的RNA的种类 109

方案：从叶中分离RNA 110

方案：从树皮中分离RNA 112

方案：从果实中分离RNA 113

从其他植物组织分离RNA的策略 115

从植物组织分离RNA的困难解决 116

参考文献和建议阅读 117

5带PolyA尾的RNA的分离 121

概述 121

加PolyA尾 122

利用Poly （A）时的注意事项 123

例1 124

例2 124

选择带PolyA尾的分子 126

用于提纯Poly （A）+的磁珠技术 127

Oligo （dT）-纤维素柱层析 129

方案：大量Poly （A）+RNA的提纯 130

不用柱的快速Poly （A）+提纯 135

方案：不用柱的Poly （A）+提纯 135

参考文献 136

6 RNA制品的质量控制 139

概述 139

质控技术1：紫外分光光度法和光吸收比 140

分光光度法 140

核酸浓度的测定 141

核酸纯度的测定 143

非分光光度法 145

质控技术2：RNA的电泳图 147

方案 149

质控技术3：紫外光投影 150

方案 151

质控技术4：样品支持RT-PCR的能力 152

质控技术5：Northern分析 153

质控技术6：样品支持体外翻译的能力 153

参考文献 154

7棘手的核糖核酸酶 155

概述 155

核糖核酸酶活力的去除 156

潜伏的RNase污染问题 157

核糖核酸酶抑制剂的种类 158

专一抑制剂 158

氧钒核糖核苷络合物 158

RNasin？ 159

非专一抑制剂 160

仪器和试剂的准备 161

焦碳酸二乙酯 162

代替剂：灭菌水 164

过氧化氢 164

氢氧化钠和十二烷基硫酸钠 165

控制核酸酶活力用的其他试剂 165

盐酸胍 165

硫氰酸胍 165

十二烷基硫酸钠 166

N-十二烷基肌氨酸 166

酚：氯仿：异戊醇 166

8-羟基喹啉 167

氯化铯 167

三氟乙酸铯 168

蛋白酶K 168

“RNAlater”（商品名） 169

方案：氧钒核糖核苷络合物的合成 169

参考文献 170

8严谨度：影响核酸结构的条件 173

双链分子的种类 173

控制严谨度的重要性 174

盐对严谨度的影响 176

pH对严谨度的影响 176

温度对严谨度的影响 177

甲酰胺对严谨度的影响 177

尿素对严谨度的影响 177

参考文献 178

9 RNA电泳 179

概述 179

核酸的标准化 180

方案：Poly （A）的标准化 183

样品制备 183

琼脂糖凝胶电泳的RNA变性系统 185

甲醛变性 187

方案：甲醛变性胶 188

尿素变性 189

方案：尿素变性 191

乙二醛、二甲基亚砜变性 191

方案：RNA的乙二醛化和电泳 192

用非变性胶跑RNA电泳 194

分子量标准 194

分子大小标准的恰当应用 195

核糖体RNA 197

凝胶染色技术 204

溴乙锭 204

SYBR绿 207

SYBR金 207

安全SYBR 208

“GelStar”染色剂 209

银染色 209

吖啶橙 210

亚甲基蓝 210

安全考虑和仪器维护 212

第一次跑琼脂糖电泳：一些提示 213

基本词汇表 213

要牢记的几点 213

参考文献 216

10照相记录和影像分析 221

概述 221

安全第一 222

数字影像分析 223

影像格式 228

实际的考虑 229

适用于任何预算的数字影像分析 231

影像分析学习班 232

磷屏显像仪 232

传统的照相记录方法 233

样品显影 234

滤光 234

将电泳图谱最优化的几点提示 235

照相底片和X光片的内在局限性 238

参考文献和建议阅读 239

11 Northern分析 241

概述 241

滤膜的选择 242

硝酸纤维素膜 243

尼龙膜 244

聚偏二氟乙烯膜 245

处理和滤膜准备 245

Northern转移技术 246

毛细现像转移 246

“TurboBlotter”转移器 247

负压转移 248

电转移 249

碱性转移 249

方案：利用被动的毛细扩散转移RNA 250

方案：用TurboBlotter向下转移RNA 252

滤膜转移后的处理 254

甲醛变性系统 254

乙二醛变性系统 254

选择1 254

选择2 255

固定化技术 255

烘烤 255

紫外光交联 256

方案：用紫外光把RNA交联在尼龙膜上 257

滤膜固定后的处理 257

逆Northern分析 258

参考文献 259

12核酸探针技术 261

概述 261

探针的分类 263

选择标记系统 263

同位素标记 265

尽可能避免分解问题 266

非同位素标记 267

通用染料Cy3和Cy5 267

常用的化学发光方式 268

生物素 268

洋地黄苷原 270

荧光素 271

直接酶标记 271

DNA探针 272

DNA探针的合成 273

聚合酶链式反应 274

随机引物反应 274

缺口转移 274

5＇末端标记 275

3＇末端标记 275

反义RNA探针 276

RNA探针的特征 278

RNA探针的合成 278

体外转录 278

5＇末端标记 279

3＇末端标记 279

探针的纯化 279

探针的保存 280

参考文献 281

13核酸杂交的实践 283

概述 283

影响杂交动力学和双链稳定性的因素 284

温度 285

离子强度 286

pH 287

探针长度 287

探针浓度 287

G+C含量 288

错配 288

探针复杂度 289

粘度 289

甲酰胺 290

尿素 290

杂交温度 291

长探针的熔点温度 291

寡核苷酸探针的熔点温度 292

杂交和Northern分析 292

预杂交：滤膜的准备 293

方案：长探针预杂交 293

探针变性 294

杂交 295

杂交后的严谨度洗涤 295

除去探针和重杂交 296

方案：除去探针的通用方法 297

参考文献 298

14检出的原理 301

概述 301

放射自显影 302

滤膜的处理 304

X光片 305

安全灯 306

曝光时间 306

增感屏 307

荧光显影 308

胶片预闪光 309

片匣的种类 309

显影和定影 310

方案：放射自显影 310

非同位素方法 312

生物素 313

洋地黄苷原 313

荧光显影 314

直接酶标 314

用化学发光检出 314

化学发光的底物 315

显色检出方法 317

数字影像系统 318

参考文献 320

15用抗核酸酶技术定量特定的mRNA 321

概述 321

基本方法 322

探针的选择 327

最优化建议 329

潜在困难 330

方案：用S1核酸酶分析定量转录物 332

方案：用抗核糖核酸酶检验定量转录物 335

困难解决 337

参考文献 338

16核RNA的分析 341

概述 341

转录速率的检验 343

与稳态RNA研究的关系 346

核Run-off与核Run-on检验 347

方案：核Run-off检验 348

细胞的收获和细胞核的制备 349

制备易破细胞核的另一方法 349

从整块组织制备细胞核的另一方法 350

转录物的标记和回收 351

靶DNA的制备 353

杂交用RNA的制备 354

杂交后的洗涤和检出 355

方案：核Run-off检验的另一方法 356

方案：抗核酸酶检验-脉冲标记转录检验 357

区分各种RNA聚合酶的活力 359

提取核RNA用于稳态分析 360

方案：直接分离核RNA 361

方案：从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA 362

核RNA分析的困难解决 363

参考文献 364

17 cDNA合成 367

概述 367

cDNA合成——概论 368

合成第一链的考虑 369

逆转录酶的选择 372

合成第二链的考虑 375

经典方法 376

基于PCR的方法 377

方案：第一链cDNA合成 377

评估cDNA合成的效率 379

克隆cDNA 379

连接的考虑 381

用于连接的酶 383

应用 383

参考文献 384

18逆转录PCR：一种科学和技术形式 385

概述 385

PCR——概论 386

逆转录PCR一般研究 391

PCR样品间沾染的防止 395

实验室的设计 395

程序方法 396

阻挡气溶胶的窍门 397

尿嘧啶-N-糖苷酶 398

引物设计 398

基本规则 402

Tm的考虑 406

估计Tm 406

Tm的精确计算 407

网上资源 407

多重引物的设计 407

最优化手续 408

热稳定聚合酶 411

正对照 413

负对照 413

热启动PCR 413

锁定的核酸 415

降落PCR 416

内对照 416

关于转录调控 419

PC R产物的分析 420

逆转录PCR质量控制的注意点 421

验证来自PCR的数据的非PCR方法 423

相关技术 424

5＇ RACE PCR 424

5＇ RLM-RACE 426

3＇ RACE-PCR 426

巢式PCR 428

长距离PCR 429

单细胞PCR 431

发夹式接头PCR 433

猎取可变转录起始位点 434

方案：第一链cDNA合成 435

方案：cDNA的PCR扩增 436

克隆PCR产物 437

方案：把平头PCR产物加A尾 438

方案：TA克隆的连接反应 438

“拓扑”克隆 440

其他扩增方法 441

RNA的线性扩增（Eberwine过程） 441

链替换扩增 442

基于核酸序列的扩增（NASBA） 443

连接酶链式反应 443

参考文献 443

19定量PCR技术 449

概述 449

灵敏度指数 450

定量研究 451

实时PCR 453

实时PCR平台 456

SYBR绿检验 457

TaqMan？检验 458

分子信标 458

“LUX”牌引物 460

“蝎子”引物 461

熔点曲线分析 462

内对照 463

外对照 463

对照反应的设置方式 467

负对照的考虑 471

竞争PCR：关键的考虑 472

竞争PCR：所包括的主要步骤 477

另一方法：非实时竞争PCR 479

方案：竞争PCR 480

非同源竞争物的合成 480

第1链cDNA的合成 481

竞争PCR（一级扩增） 482

竞争PCR（二级扩增） 484

影像分析的考虑 485

定量PCR技术的困难解决 486

参考文献 488

20功能基因组学和转录物总体分析 491

概述 491

功能基因组学的定义 491

功能基因组学研究方法的重要性 492

常用的功能基因组学研究方法 493

功能基因组学和经典分子生物学 496

21基因表达的高通量分析 499

概述 499

什么是微阵列？ 500

什么是热图？ 502

微阵列能做什么？ 504

微阵列不能做什么？ 504

微阵列分析的主要步骤 507

参考RNA 509

宏阵列是什么？ 510

应用 512

参考文献 512

22整体分析基因表达的非阵列方法 515

概述 515

基本问题 516

消减方法 517

抑制性消减杂交（SSH） 517

困难解决 524

非消减方法 526

mRNA差别显示 526

各种方案 529

参考文献 536

23 RNA干扰：Dicer酶在RISC复合物中起作用 539

概述 539

RNAi的基本名词 541

RNA干扰——它如何工作 542

siRNA方法 545

shRNA方法 546

将siRNA导入哺乳动物细胞的方法 548

miRNA 549

siRNA的有效设计 550

RNAi和转录物可变剪切 552

体外和体内问题 553

RNAi的确认 555

RT-PCR方法 556

Northern杂交分析 556

Western杂交分析 556

应用 557

参考文献 557

24基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学 561

概述 561

基本名词 563

基因组和基因组学 564

转录组和转录组学 565

蛋白质组和蛋白质组学 566

生物信息学 571

搜索基因——BLAST一下！ 571

参考文献 573

25 RNA一例 575

一个典型实验？ 577

灵敏度问题 580

下一步做什么 580

到哪儿去求助 582

尾声 585

几粒智慧之珠 585

附录A保留完整准确的记录 591

附录B把质量转换为摩尔 593

附录C对分子生物学家有用的储存液 597

附录D酚的制备 603

附录E溴乙锭和SYBR绿溶液的弃去 607

附录F用DNase Ⅰ从RNA样品中除去DNA 611

附录G用RNase保温从DNA样品中除去RNA 613

附录H甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子 615

附录I硅化离心管和玻璃器具 617

附录J贴壁细胞的胰酶处理方案 619

附录K盐析法分离高分子量DNA 621

附录L电泳：原理、参数和安全 625

附录M聚丙烯酰胺凝胶电泳 637

附录N点杂交分析 641

附录O离心是分子生物学家的主流工具 649

附录P仪器和试剂供应商及服务商选登 655

附录Q有用的国际单位制单位 663

附录R常用缩写 665

附录S商标摘录 667

术语表 671

索引 693