组织细胞分子学实验原理与方法PDF电子书下载

目录 1

第一章　组织学实验方法 1

第一节　组织学制片概述 1

一、组织学制片方法 1

（一）切片法 1

（二）非切片法 1

二、组织切片标本制作程序 2

（一）切片制作中的各种操作 2

（二）切片的主要程序 2

第二节　取材 3

一、动物的处死方法 3

二、取材注意事项 4

三、取材的方法 4

（一）肌组织取材 4

（二）消化系统取材 5

（三）泌尿系统取材 6

（四）呼吸系统取材 7

（五）循环系统取材 7

（六）淋巴器官取材 8

（七）生殖系统取材 8

（八）神经系统取材 8

第三节 固定和固定液 9

一、固定及固定的方法 9

（一）固定 9

（二）目的和意义 9

（三）对象和方法 10

（四）固定剂的性质和条件 11

（五）固定剂的作用、穿透率和媒染效果 11

（六）注意事项 12

（一）单纯固定液 13

二、固定液 13

（二）混合固定液 18

第四节 固定后的处理 20

一、洗涤 20

（一）洗涤的目的 20

（二）洗涤的方法 20

二、脱水 21

（一）脱水的目的和原则 21

（二）脱水剂的种类和效果 21

（三）常用脱水剂 22

（四）脱水时间 22

三、透明 23

（一）透明的目的 23

（二）透明剂的种类和使用方法 23

（二）浸蜡剂的种类 24

四、浸蜡与包埋 24

（一）浸蜡的目的和方法 24

五、包埋 25

（一）石蜡包埋法 25

（二）体液石蜡包埋法 25

（三）快速石蜡包埋法 25

（四）火棉胶包埋法 26

（五）明胶包埋法 26

六、脱水、透明和浸蜡时间 27

七、石蜡包埋注意事项 30

第五节　组织制片（切片）法 30

一、组织切片机 30

（一）石蜡切片机 30

（三）冰冻切片机 31

（二）火棉胶切片机 31

（四）切片机的保养 32

二、组织切片刀 32

（一）切片刀的种类 32

（二）磨切片刀的器具及磨刀法 32

三、切片方法 33

（一）石蜡切片法 34

（二）冰冻切片法 37

（三）火棉胶切片法 38

第六节　染料、染色及染色方法 39

一、染料 39

（一）天然染料 39

（二）人工合成染料 40

（一）染色历史 43

二、染色 43

（二）染色目的 44

（三）染色原理 44

（四）染色 45

（五）染色术语 47

三、苏木素-伊红染色 48

（一）苏木素来源 48

（二）苏木素染核原理 48

（三）苏木素染液化学性质 48

（四）苏木红和媒染剂 49

（五）各种染色液的配制 49

（六）明矾苏木素液的蓝化和分化 50

（七）明矾苏木素液的选用 50

（九）伊红Y染色液和促进剂 51

（十）伊红Y染色液的选用 51

（八）伊红Y的化学性质 51

（十一）HE染色的步骤 52

（十二）常规HE染色应注意的问题 53

四、特殊染色 54

（一）胶原纤维染色法 54

（二）六胺银染色法 56

第七节　神经组织的切片制备 58

一、固定 58

（一）固定液的配制 59

（二）固定方法 60

二、石蜡包埋法 61

（一）浸蜡 61

（二）包埋 62

三、恒冷切片机和切片法 62

四、振动切片机切片法 63

第二章　电镜标本制备方法 64

第一节　超薄切片方法 64

一、配制固定液 64

二、取材与固定 66

（一）取材的要领 66

（二）固定的目的和要求 67

三、脱水 69

（一）脱水损伤问题 69

（二）脱水方案 70

四、包埋 71

五、超薄切片前的准备 72

六、超薄切片 77

（一）超薄切片机和超薄切片形成原理 77

（三）水槽液及水槽液面的调节 79

（四）标本块与刀刃的调整 79

（二）刀口的选择 79

（五）切片 80

（六）切片的展开和切片的 81

捞取方法 81

（七）制备优良的超薄切片的条件 81

（八）切片的缺陷及其排除法 82

七、超薄切片的常规染色 83

（一）染液的配制 84

（二）染色操作 84

第二节　扫描电镜标本制备方法 86

一、取材和固定 86

二、脱水和干燥 87

三、喷镀 88

一、细胞的特点 90

第一节　细胞概述 90

第三章　细胞学实验方法 90

二、细胞的结构及生理功能 93

（一）细胞膜结构及生理功能 93

（二）细胞内膜系统及生理功能 94

（三）细胞核结构及生理功能 97

（四）细胞膜上的特化结构 98

（五）细胞连接 99

（六）细胞外基质 100

三、细胞的研究方法和应用 100

（一）细胞的研究方法 100

（二）细胞的选择 103

（三）在毒理学研究中的应用 104

（四）在测定血药浓度中的应用 106

（六）在病毒分离和培养中的应用 107

（五）在疫苗研制方面的应用 107

（七）检测材料的生物相容性 108

第二节 普通细胞培养方法 109

一、培养的基本概念 109

（一）细胞培养及组织培养 109

（二）细胞的形态分类与分化 110

（三）细胞的生长与增殖特点 112

（四）细胞增殖及生理功能的测定 116

（五）污染的防治 121

附一 支原体的检测与去除 125

附二 内毒素污染的检测与去除 130

附三 细胞培养室无菌制度 133

二、细胞培养的条件 133

（一）细胞培养室设施 133

（二）生长环境 135

（三）培养试剂 136

（四）培养用品的清洗与消毒 139

三、原代分离细胞培养 141

（一）原理和应用 141

（二）实验步骤 143

（三）注意事项 143

四、传代培养及细胞的冻存复苏 144

（一）支持物培养贴壁细胞 144

（二）细胞冻存 145

（三）细胞复苏 145

第三节　特殊细胞培养方法 146

一、贮脂细胞的分离与培养 146

（一）原理与应用 146

（二）细胞的分离与培养 147

（四）FSC细胞的鉴定及活力判断 148

（三）FSC细胞的分离纯化 148

（五）FSC细胞的原代培养 149

（六）功能检测 149

（七）注意事项 149

二、肾小球系膜细胞的分离与培养 149

（一）原理和应用 149

（二）细胞的分离与培养 150

（三）注意事项 151

三、内皮细胞的分离与培养 151

（一）原理与应用 152

（二）细胞的分离与培养 152

（三）细胞的鉴定 153

（四）注意事项 153

（二）细胞的分离与培养 154

（一）原理和应用 154

四、神经细胞培养 154

（三）注意事项 157

第四章　一般组织化学 158

第一节　核酸与核蛋白 159

一、显示DNA和RNA的方法 160

（一）福尔根反应 160

（二）甲基绿-派络宁（Kurnick法）反应 161

（三）甲基绿-派络宁（Elias法）反应 163

（四）甲基绿-派络宁（张作干法）反应 164

（五）吖啶橙反应 164

二、核酸的消化反应 165

（一）核糖核酸酶的消化反应 165

（二）脱氧核糖核酸酶的消化反应 166

三、显示核蛋白的方法 167

（一）碱性固绿反应 167

（二）肝素-阿尔新蓝反应 168

第二节　蛋白质 169

一、显示氨基的方法 169

（一）二硝基氟苯法 169

（二）汞-溴酚蓝法 171

二、显示酪氨酸的方法 172

（一）米伦反应 172

（二）酪氨酸重氮化偶联反应 172

三、显示半胱氨酸和胱氨酸的方法 174

（一）汞橙反应 174

（二）DDD重氮蓝-B反应 175

第三节　碳水化合物 177

一、碳水化合物的化学 177

（一）单糖 177

（二）寡糖和多糖 181

（三）糖蛋白和蛋白聚糖 183

二、碳水化合物的组织化学分类 184

三、显示糖原的方法 185

（一）高碘酸-雪夫反应 185

（二）胭脂红染色法 187

四、显示酸性糖共轭物的方法 188

阿尔新蓝染色 188

第四节　脂类 189

一、显示脂类的脂溶性染料染 190

色法 190

（一）油红O示脂类法 191

（二）苏丹黑-B示脂类法 192

二、显示脂类的化学方法 193

（一）四氧化锇示脂类法 193

（二）脂肪酶-硝酸铅反应法 194

第五节 酶 195

（一）碱性磷酸酶 198

一、磷酸酶 198

（二）酸性磷酸酶 201

（三）三磷酸腺苷酶 204

（四）葡萄糖-6-磷酸酶 208

（五）5'-核苷酸酶 209

二、羧酸酯水解酶 210

（一）非特异性酯酶 210

（二）脂酶 213

（三）乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶 216

三、焦磷酸酶 219

（一）硫胺素焦磷酸酶 219

（二）硫胺素单磷酸酶 221

（三）硫胺素三磷酸酶 222

（一）细胞色素氧化酶 223

四、氧化酶 223

（二）过氧化物酶 227

（三）过氧化氢酶 228

（四）单胺氧化酶 229

五、脱氢酶 232

（一）琥珀酸脱氢酶 232

（二）乳酸脱氢酶 235

（三）谷氨酸脱氢酶 238

（四）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 240

六、碳酸酐酶 241

第五章　免疫组织化学 244

第一节 免疫组织化学的基本原理 244

一、抗原的提取 244

二、抗体的制备 245

（一）单克隆抗体的制备 246

（二）多克隆抗体的制备 247

三、抗体的纯化 248

四、抗体标记 249

第二节　组织细胞材料的制备 250

一、取材与贮存 251

（一）组织标本 251

（二）细胞标本 251

二、固定 252

（一）固定液 252

（二）固定方法 253

三、脱水、包埋 253

（一）脱水、包埋程序 253

（二）石蜡切片 254

（一）载玻片和盖玻片的处理 254

四、切片 254

（二）包埋方法 254

（三）冰冻切片 255

第三节　免疫组织化学染色法 255

一、免疫过氧化物酶组织化学染色法 256

（一）直接法 257

（二）间接法 257

（三）过氧化物酶抗过氧化物酶法 258

（四）亲和素-生物素复合物法 259

（五）标记链霉亲和素-生物素法 260

二、非过氧化物酶免疫组织化学染色法 261

（一）免疫胶体金方法 261

（二）免疫碱性磷酸酶染色法 263

（三）免疫双重或多重标记法 263

（一）内源性过氧化物酶 264

（二）内源性生物素 264

第四节 免疫组织化学染色的非特异性着色对策、对照设计及结果判断 264

一、免疫组织化学非特异性着色及对策 264

（三）电荷吸附 265

（四）一抗与二抗 265

（五）切片制备 265

（六）切片洗涤 265

（七）DAB显色 266

二、对照设计及染色结果判断 266

（一）对照设计 266

（二）染色结果判断 266

一、标本制备 267

（一）取材与固定 267

第五节　免疫电镜方法 267

（二）免疫染色 268

（三）包埋 268

二、透射免疫电镜方法 268

（一）免疫铁蛋白方法 268

（二）过氧化物酶方法 269

（三）胶体金标记免疫电镜技术 269

三、扫描免疫电镜方法 269

四、冷冻蚀刻免疫电镜方法 270

第六章　荧光组织化学 271

第一节　荧光显微镜 271

一、光源 271

二、滤光片系统 272

二、诱发荧光 273

一、自发荧光 273

四、荧光染色 273

三、酶促荧光 273

第二节　组织和细胞荧光分类 273

四、荧光显微镜照相 273

三、聚光器 273

五、免疫荧光 274

第三节　生物单胺荧光组织化学方法 274

一、乙醛酸诱发生物单胺荧光法 274

二、邻苯二醛显示组织胺荧光法 276

一、吖啶橙区分活细胞DNA和RNA荧光染色法 277

第四节　一般荧光组织化学方法 277

二、溴化乙啶荧光显示脱氧核糖核酸法 279

三、溴化乙啶荧光显示核糖核酸法 279

附：绿色荧光蛋白 280

第五节 免疫荧光组织化学方法 281

一、免疫荧光化学染色法原理 281

二、免疫荧光化学染色方法 282

（一）荧光素标记抗体的制备 282

（三）荧光抗体的染色 287

（二）荧光标记抗体的纯化 287

（四）染色标本的保存及封片介质的制备 290

三、免疫荧光方法的应用 290

第七章　原位杂交组织化学 292

第一节　原位杂交的基本方法 292

一、组织与细胞的固定 293

（一）多聚甲醛固定 293

（二）固定液评价 293

（三）4％多聚甲醛配制 293

二、玻片和组织切片的处理 294

（一）玻片的处理 295

（二）粘附剂的使用 295

（三）切片及细胞标本制作 296

（四）增强组织通透性及探针的穿透性 297

（三）杂交液 298

（二）杂交的温度与时间 298

（一）探针的浓度与长度 298

三、杂交反应 298

四、杂交后处理 299

五、杂交后显示 299

六、对照实验和结果判断 299

第二节　常用原位杂交方法 301

一、同位素标记探针原位杂交法 302

（一）组织细胞处理 302

（二）杂交反应 303

（三）杂交后漂洗 303

（四）放射自显影和复染 303

二、生物素标记探针原位杂交法 304

（一）组织细胞处理 304

（二）杂交反应 304

（三）显示 304

（二）杂交反应 305

（三）显示 305

三、地高辛标记探针原位杂交法 305

（一）组织细胞处理 305

四、PCR与原位杂交结合法 306

（一）基本原理 306

（二）操作步骤 306

（三）显示 306

五、电镜原位杂交法 307

（一）生物素标记DNA探针-PA-gold电镜原位杂交法 307

（二）地高辛标记rRNA探针电镜原位杂交法 309

第三节 原位杂交结合免疫组织化学方法 310

一、同位素原位杂交联合免疫组织化学PAP法 311

（一）基本原理 311

（二）操作步骤 311

（二）操作步骤 312

二、地高辛标记联合PAP法 312

（一）基本原理 312

第八章　定量组织化学 314

第一节　显微分光光度术 314

一、显微分光光度计的原理和结构 314

（一）原理 315

（二）结构 315

二、显微分光光度计测量的基本方法 316

（一）标本的制备和染色 316

（二）测量方法 317

（三）注意事项 318

三、显微分光光度计的应用 318

（一）细胞生物学研究中的应用 318

（二）肿瘤作用机制研究中的应用 321

（三）肿瘤细胞DNA定量研究中的应用 322

（一）流式细胞仪组成 324

第二节　流式细胞术 324

一、流式细胞仪的原理和结构 324

（二）工作原理 326

（三）流式细胞仪测量信号获取与显示 327

（四）流式细胞仪的主要技术指标 331

二、流式细胞仪样品制备 331

（一）实体组织 331

（二）培养细胞 333

（三）脱落细胞悬液 333

（四）石蜡包埋样品 334

三、染色方法 334

（一）DNA染色方法 334

（二）RNA染色方法 334

（五）免疫荧光法标记细胞表面抗原及细胞内特异蛋白 335

（三）DNA与RNA同时染色法 335

（四）同时分析细胞的DNA和总蛋白 335

三、流式细胞仪的应用 337

（一）肿瘤学方面的应用 337

（二）免疫学方面的应用 338

（三）药物抗肿瘤方面的应用 338

第三节　激光扫描共聚焦显微术 339

一、激光扫描共聚焦显微镜的原理和结构 340

（一）原理 340

（二）结构 342

二、激光扫描共聚焦显微镜的功能 345

（一）激光扫描共聚焦显微镜的静态观察 345

（二）激光扫描共聚焦显微镜的动态观察 347

（一）细胞内Ca2+、pH值的测定 348

三、激光扫描共聚焦显微镜的应用 348

（二）细胞酶活性的测定 350

（三）细胞物质转运的测定 350

（四）细胞受体的测定 350

（五）在细胞凋亡研究中的应用 351

（六）在神经学研究中的应用 351

（七）在中药抗肿瘤研究中的应用 352

（八）在针灸经络研究中的应用 353

第四节　图像分析仪 353

一、图像分析仪的原理和结构 355

（一）原理 355

（二）结构 355

二、图像分析仪的工作程序 356

（一）图像的形成 357

（二）图像的获取 357

（三）图像的检测 358

（四）图像的分析 359

（五）图像的修正 361

（六）图像系统的误差分析 362

三、图像分析仪在生物医学方面的应用 364

第九章　显微摄影技术 365

第一节　显微摄影基础知识要点 366

一、显微摄影系统的常用组件 366

二、显微摄影常见技术指标 366

第二节　显微摄影的一般步骤和拍摄技巧 367

一、摄影前的准备工作 367

二、显微摄影技术要领 368

第三节　显微摄影的技巧 370

一、黑白显微摄影的技巧 370

二、彩色显微摄影的技巧 372

二、图像反差过低 373

三、图像亮度不均匀 373

第四节　显微摄影技术中常见问题与纠正 373

一、显微成像不清 373

四、拍摄中曝光不准确 374

第五节 显微摄影照片放大倍数计算方法 374

一、显微镜放大倍数 374

二、显微镜底片上的图像放大倍数 374

三、放大或扩印照片的放大倍数 374

第六节　显微摄影技术展望 375

附录一　常用试剂的配制 376

附录二　常用缓冲溶液及其配制 381

附录三　英汉名词对照 397

附录四　汉英名词对照 406

主要参考文献 415