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第一篇 微生物学基本实验技术 2

第一章 微生物学实验室设备及实验器材 2

第一节 细菌学实验室建设 2

一、细菌学实验室设置基本条件 2

二、基本设备和器具 2

三、几种仪器的管理和使用 2

第二节 病毒学实验室的建设 3

一、病毒学实验室的设置要求 3

二、几种仪器的保护与使用 4

第三节 常用实验器材的准备 5

一、清洁法 5

二、消毒与灭菌法 7

【附1-1】清洗液的配制 9

参考文献 10

第二章 细菌的形态学检查方法 11

第一节 细菌大小的测定方法 11

一、基本原理 11

二、器材 11

三、试验方法 11

第二节 细菌形态的检查方法 12

一、检查工具——普通光学显微镜的使用及保护 12

二、暗视野显微镜检查法 14

三、细菌不染色标本检查法 15

四、细菌染色标本检查法 15

第三节 细菌特殊结构的检查方法 18

一、英膜染色法 18

二、鞭毛染色法 19

三、芽孢染色法 20

参考文献 21

第三章 细菌的培养技术 22

第一节 培养基的种类和应用 22

一、培养基的种类 22

二、培养基的应用 22

第二节 培养基的制备 23

一、调配 23

二、溶化 23

三、校正pH值 23

四、澄清过滤 23

五、分装 24

六、灭菌 24

七、检定 24

八、保存 24

第三节 细菌培养分类及应用 24

一、分批培养 24

二、连续培养 24

三、应用 25

第四节 细菌的培养 25

一、细菌的接种方法 25

二、细菌的培养方法 27

三、细菌L型的分离培养 28

【附3-1】Diene染色法与857培养基的制备 30

参考文献 31

第四章 细菌的生化鉴定 32

第一节 糖（醇）类代谢试验 32

一、氧化-发酵试验（OF试验） 32

二、甲基红试验（MR试验） 32

三、V-P（Voges-Proskauer）试验 33

四、β-半乳糖苷酶试验 33

五、七叶苷水解试验 34

六、淀粉水解试验 34

七、甘油复红试验 34

八、石蕊牛乳试验 35

第二节 氨基酸和蛋白质代谢试验 35

一、靛基质（吲哚）试验 35

二、硫化氢试验 35

三、尿素酶试验 36

四、明胶液化试验 36

五、苯丙氨酸脱氨酶试验 36

六、氨基酸脱羧酶试验 37

七、精氨酸双水解酶试验 37

八、肉渣消化试验 37

第三节 有机酸盐和胺盐利用试验 38

一、枸橼酸盐利用试验 38

二、丙二酸盐利用试验 38

三、马尿酸钠水解试验——三氯化铁法 38

四、马尿酸钠水解试验——茚三酮法 39

五、乙酸盐利用试验 39

六、惟一碳源试验 39

七、惟一氮源试验 40

八、生长因子试验 40

第四节 呼吸酶类试验 41

一、过氧化氢酶试验 41

二、氧化酶试验 41

三、硝酸盐还原试验 41

四、氯化三苯四氮唑试验 42

第五节 毒性酶类试验 43

一、血浆凝固酶试验 43

二、磷酸酶试验 43

三、链激酶试验 43

四、卵磷脂酶 44

五、DNA酶试验 44

第六节 其他试验 44

一、胆盐溶菌试验 44

二、CAMP试验 45

三、杆菌肽抑菌试验 45

四、Optochin敏感试验 45

五、新生霉素抑菌试验 46

六、呋喃唑酮抑菌试验 46

七、0/129抑菌试验 46

参考文献 47

第五章 病毒的观察、培养鉴定及检测方法 48

第一节 电子显微镜观察病毒法 48

一、电子显微镜 48

二、电镜负染观察病毒方法 48

三、免疫电镜观察病毒形态 49

第二节 病毒的分离培养与鉴定 49

一、鸡胚培养技术 50

二、组织培养技术 52

三、动物接种 56

第三节 血清学检查法 58

一、中和试验 58

二、血凝及血凝抑制试验 61

三、补体结合试验 62

四、凝胶免疫扩散试验 62

参考文献 63

第六章 真菌的常规检查法 64

第一节 真菌的一般检验法 64

一、不染色标本直接检验法 64

二、染色标本检查法 65

第二节 产毒真菌的检验 65

【附6-1】常见霉菌特征 67

第三节 真菌的培养方法 68

一、斜面培养 68

二、玻片培养 68

三、平板培养法 69

第四节 酵母菌的检查与鉴定 69

一、酵母菌直接镜检计数法 69

二、酵母菌的鉴定 69

三、白假丝酵母菌的鉴定 69

四、隐球菌的鉴定 70

参考文献 70

第七章 支原体的检测 71

第一节 概述 71

一、分离培养技术 71

二、支原体分型试验 71

三、支原体污染细胞培养的检测方法 73

第二节 细胞培养中支原体污染的检测 74

一、培养法检测支原体 74

二、荧光染色法（DNA染色法）检测支原体 74

三、PCR法检测支原体 76

四、支原体的扫描电镜检测 77

参考文献 79

第八章 衣原体的检测 80

一、衣原体特异性抗原和抗体检测 80

二、特异性核酸检测 81

参考文献 81

第九章 微生物数量的测定 82

第一节 显微镜直接计数法 82

一、材料 83

二、方法 83

第二节 平板培养计数法 84

一、材料 84

二、方法 84

第三节 最大可能数计数法 85

一、材料 86

二、方法 86

第四节 光电比浊计数法 86

一、材料 86

二、方法 87

第五节 滤膜法 87

一、材料 87

二、方法 87

第六节 病毒计数 88

一、材料 88

二、方法 88

三、影响蚀斑形成的因素 88

参考文献 89

第十章 微生物毒力的测定 90

第一节 内毒素的测定——鲎试验 90

一、材料 90

二、方法 90

三、结果 90

第二节 外毒素的毒性检测 90

一、材料 91

二、方法 91

三、结果 91

第三节 病毒毒力测定 91

一、材料 92

二、方法 92

三、注意事项 93

第四节 细菌毒力的检测 93

一、材料 93

二、方法 93

参考文献 94

第十一章 菌株、毒株的保存方法 95

第一节 菌株的保存与管理 95

一、菌种的保存 95

二、菌种保管 95

三、常用的保存菌种的方法 96

第二节 毒株的保存 99

参考文献 100

第十二章 药物敏感试验 101

第一节 细菌的耐药机制 101

一、细菌耐药性的概念 101

二、细菌耐药性的产生机制 101

第二节 需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感性试验 105

一、体外药敏试验的抗菌药物选择 105

二、抑菌试验 108

三、联合药物敏感试验和杀菌试验 119

四、检测细菌耐药性的其他方法 121

第三节 厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验 130

一、稀释法 130

二、E试验 132

第四节 酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验 132

一、常量（试管）肉汤稀释法 132

二、微量肉汤稀释法 133

第五节 结核分枝杆菌的体外抗菌药物敏感试验 133

一、临床实验室进行结核分枝杆菌体外抗菌药物敏感试验的指征 133

二、体外药敏试验抗分枝杆菌的药物选择 133

三、抗分枝杆菌药物原液的配制及保存 133

四、培养基 133

五、结核分枝杆菌体外药敏试验方法 133

六、结核分枝杆菌体外药敏试验的质控菌株 135

参考文献 135

第十三章 微生物实验室质量控制 137

第一节 常规仪器的质量控制 137

一、灭菌器的效果检测 137

二、恒温孵育箱、水浴箱及冰箱 138

三、厌氧箱及厌氧罐 138

四、CO2培养箱 138

五、生物安全罩 138

六、细菌培养仪 139

七、微生物鉴定仪 139

八、其他仪器 139

第二节 标准菌株的质量控制 139

一、质控标准菌株应具备的条件 139

二、质控标准菌株的来源 139

三、标准菌株的保存 139

第三节 培养基的质量控制 140

一、建立制备培养基的记录 140

二、培养基的外观检查 141

三、无菌试验 141

四、培养基的一般质量控制 141

五、培养基的性能监测 142

第四节 药敏试验的质量控制 143

一、扩散法的质量控制 143

二、稀释法的质量控制 147

三、用标准菌株对厌氧菌药敏试验进行质量控制 149

四、结核分枝杆菌药敏试验的质量控制 150

第五节 其他项目的质量控制 150

一、试剂、染色液及抗血清的质量控制 150

二、处理临床标本的质量控制 152

参考文献 153

第二篇 与微生物相关的实验技术 156

第十四章 细胞培养技术 156

第一节 概述 156

一、培养细胞的生长类型 156

二、培养细胞的生长特点 156

三、培养细胞的生长条件 157

第二节 常用的细胞培养方法 158

一、原代培养 158

【附14-1】培养要点 159

二、传代细胞培养 160

三、二倍体细胞培养 161

四、其他培养（包括大规模培养）方法 161

第三节 培养细胞的生长、增殖及其观察 163

一、培养细胞的生长和增殖 163

二、培养细胞生长和增殖的观察 164

第四节 培养细胞的保存和运输 165

一、组织块保存法 165

二、细胞悬液保存法 165

三、单层细胞保存法 165

四、低温冻结保存和复苏 166

五、细胞运输 166

第五节 培养细胞污染的检测排除 166

一、生物污染的检测 166

二、微生物污染的防治 167

第六节 培养细胞基本设备与器具 168

一、基本设备 168

二、常用器械 169

三、培养器皿 169

第七节 细胞培养液 170

一、生理平衡盐溶液 170

二、天然培养基 170

三、合成培养液 171

四、生长液和维持液 171

五、无血清培养液 172

第八节 细胞培养在病毒研究中的应用 172

一、细胞培养的应用 172

二、判断病毒生长复制的方法 172

三、细胞培养在病毒研究工作中的价值 173

参考文献 173

第十五章 抗体的制备 174

第一节 普通诊断血清的制备 174

一、免疫原的制备 174

二、免疫动物的选择 175

三、免疫方法 175

四、免疫血清的收获 176

五、免疫血清的保存 176

第二节 单克隆抗体技术 176

一、概述 176

二、B细胞杂交瘤的制备 177

参考文献 179

第十六章 免疫血清学检查方法 180

第一节 凝集试验 180

一、直接凝集反应 180

二、间接凝集反应 181

第二节 沉淀反应 183

一、液体内沉淀反应 183

二、凝胶内沉淀反应 185

第三节 补体结合试验 187

第四节 免疫荧光技术 189

一、荧光标记物的制备 189

二、荧光免疫显微技术 191

三、流式荧光免疫技术 192

四、时间分辨荧光免疫测定 192

五、荧光偏振免疫测定 193

第五节 酶免疫技术 194

一、酶的选择与试剂的制备 194

二、酶联免疫吸附测定 198

三、细胞酶联免疫吸附测定 199

四、液相酶免疫测定 203

五、均相酶免疫测定 204

第六节 放射免疫测定技术 206

一、放射免疫测定 206

二、免疫放射测定 211

三、放射受体分析 212

第七节 免疫金标记技术 213

一、基本原理 214

二、胶体金的制备 214

三、胶体金标记蛋白的制备 215

四、胶体金标记技术在免疫学试验中的应用 217

第八节 化学发光标记及发光免疫测定 219

一、发光现象 219

二、化学发光 220

三、生物发光 221

四、发光标记物 222

五、发光免疫标记技术 223

六、发光免疫分析技术 226

七、电化学发光免疫分析 228

第九节 免疫电镜技术 230

一、免疫标记方法 230

二、铁蛋白标记免疫电镜技术 231

三、酶标记免疫电镜技术 232

四、胶体金标记免疫电镜技术 232

五、凝集素标记免疫电镜技术 232

六、免疫电镜技术的不标记抗体法 233

参考文献 234

第十七章 分子生物学技术 236

第一节 细菌质粒指纹图谱分析 236

一、琼脂糖凝胶电泳 236

二、质粒的限制性内切酶分析 239

第二节 细菌DNA（G+C）含量测定 240

一、细菌DNA的提取 240

二、细菌DNA（G+C）含量测定 240

三、（G+C）含量在细菌分类鉴定中的应用 242

第三节 核酸杂交技术 245

一、膜上印迹杂交 245

二、核酸原位杂交 248

第四节 PCR技术 249

一、PCR技术的原理 249

二、PCR技术在病原体诊断方面的应用 249

三、PCR检测病原微生物应用实例 250

第五节 生物芯片技术 252

一、概述 252

二、生物芯片在医学中的应用 253

参考文献 255

第十八章 其他微生物学检测技术 256

第一节 细菌编码鉴定技术 256

第二节 细菌自动化鉴定系统 258

一、微生物数码分析鉴定系统 258

二、自动化设备 259

三、血培养检测和分析系统 260

第三节 气相色谱技术在细菌学研究中的应用 261

一、气相色谱仪 262

二、气相色谱法的特点 265

三、细菌分析应用举例 265

参考文献 267

第十九章 电泳技术 268

第一节 概论 268

一、电泳法分类 268

二、电泳的基本原理 268

三、影响被分离物质迁移率的因素 269

第二节 琼脂糖凝胶电泳 271

一、琼脂糖凝胶的性质 271

二、电泳装置 271

三、电泳缓冲液 271

四、凝胶浓度的选择 271

五、常规琼脂糖凝胶电泳 271

六、碱性琼脂糖凝胶电泳 272

七、琼脂糖电泳分离血清脂蛋白 273

第三节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 275

一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 275

二、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 277

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 278

第四节 等电聚焦电泳 280

一、试剂及器材 281

二、操作步骤 281

三、注意事项 282

四、评价 282

参考文献 282

第二十章 实验动物和动物实验技术 283

第一节 实验动物学 283

一、实验动物学的基本概念 283

二、实验动物学的研究对象 283

三、实验动物学的研究范围 283

四、实验用动物 285

第二节 实验动物 285

一、实验动物分类 286

二、实验动物对环境因素的要求 298

第三节 动物实验技术 305

一、实验动物的固定、编号和分组 305

二、实验动物的麻醉 308

三、实验动物的去毛、给药、采血和处死 309

参考文献 315

第二十一章 微生物遗传变异及相关技术 316

第一节 遗传变异的物质基础 316

一、细菌染色体 316

二、质粒 316

三、转位因子 317

第二节 细菌转化实验 318

一、材料 318

二、方法 318

三、结果 319

第三节 细菌总DNA的提取 319

一、材料 319

二、方法 319

第四节 细菌质粒DNA的提取 321

一、材料 321

二、方法 321

第五节 细菌诱发突变的实验 322

一、经紫外线诱变筛选营养缺陷型突变株 322

二、经亚硝酸诱变筛选乳糖发酵突变株 324

三、转座子引起的插入突变 325

参考文献 326

第二十二章 各种临床标本的微生物学检查 327

第一节 血液标本 327

一、实验材料 327

二、实验方法 327

三、实验结果 328

四、临床意义 329

第二节 粪便标本 329

一、实验材料 329

二、实验方法 329

三、实验结果 330

四、临床意义 331

第三节 尿液标本 331

一、实验材料 331

二、实验方法 331

三、实验结果 334

四、临床意义 334

第四节 泌尿生殖道标本 334

一、实验材料 334

二、实验方法 335

三、实验结果 337

四、临床意义 337

第五节 痰液及呼吸道标本 337

一、实验材料 337

二、实验方法 337

三、实验结果 339

四、临床意义 339

第六节 脓液及创伤感染标本 339

一、实验材料 339

二、实验方法 340

三、实验结果 341

四、临床意义 341

第七节 无菌体液（脑脊液、穿刺液）标本 341

一、实验材料 341

二、实验方法 342

三、实验结果 343

四、临床意义 344

第八节 组织标本 344

一、实验材料 344

二、实验方法 344

三、实验结果 345

四、临床意义 345

参考文献 346

第三篇 各种环境中微生物的检测 348

第二十三章 生活环境中致病菌的检测 348

第一节 水环境中致病菌的检测 348

一、水样的采集与处理 348

二、水中沙门菌的分离 348

三、水中志贺菌的分离 348

四、水中霍乱弧菌的分离 349

五、水中铜绿假单胞菌的分离 349

第二节 空气环境中致病菌的检测 349

一、固体撞击法检测空气中溶血性链球菌 350

二、自然沉降法检测空气中溶血链球菌 350

第三节 食品中常见致病菌的检测 351

一、食品中沙门菌的检测 351

二、食品中志贺菌属的检测 352

参考文献 353

第二十四章 医院感染中的微生物监测 354

第一节 医院感染的特点 354

一、医院感染的流行特点 354

二、医院感染的微生物学特点 355

第二节 医院感染的微生物学监测 356

一、空气中细菌学监测 356

二、物体表面的微生物学监测 357

三、手微生物学污染监测 358

四、敷料、纱布微生物学监测 359

五、生物制品微生物学监测 359

六、金属、玻璃器械微生物学监测 359

七、消毒液的细菌学检测 359

参考文献 360

第二十五章 新发现微生物的检测 361

第一节 SARS病毒的实验室检测 361

一、病原生物学特性 361

二、流行病学 364

三、发病机制 366

四、实验室诊断 366

五、小结——SARS诊断依据 369

附件25-1 非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南 371

附件25-2 传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法 372

第二节 禽流感病毒的实验室检测 373

一、病原生物学特性 374

二、流行病学 374

三、临床表现 375

四、诊断方法 375

五、实验室诊断 375

六、禽流感与人的关系 376

附件25-3 中华人民共和国国家标准 流行性感冒诊断标准及处理原则 377

附录A 病原学诊断方法 378

附录B 血清学诊断方法 380

附录C 红细胞凝集抑制试验 380

附录D 神经氨酸酶活性抑制试验 384

附录E 对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验 387

附录F 流感快速诊断方法 390

附件25-4 禽流感病毒的实验室检测技术方案 397

附件25-5 WHO甲5型（H5）流感病毒鉴定试剂盒的使用方法 400

参考文献 402

第四篇 生物战剂 404

第二十六章 生物战剂 404

第一节 病原微生物危险度等级 404

一、一级危险度微生物 404

二、二级危险度微生物 404

三、三级危险度微生物 404

四、四级危险度微生物 406

第二节 生物战剂概况 406

一、生物战剂的标准 407

二、攻击人的生物战剂实验室危险度 407

第三节 常用的病毒性生物战剂 408

一、克里米亚-刚果出血热病毒 409

二、汉坦病毒 410

三、天花病毒 412

四、马尔堡病毒 415

五、埃博拉病毒 416

六、森林脑炎病毒 418

七、黄热病毒 421

第四节 常用的细菌性生物战剂 422

一、炭疽芽孢杆菌 422

二、鼠疫耶尔森菌 425

三、布鲁菌 428

四、鹦鹉热衣原体 432

第五节 常用的毒素性生物战剂 434

一、葡萄球菌肠毒素 434

二、肉毒毒素 435

三、志贺毒素 436

四、破伤风毒素 437

第六节 常用的立克次体生物战剂 439

一、普氏立克次体 439

二、立氏立克次体 441

第七节 常用的真菌生物战剂 442

一、荚膜组织胞浆菌 442

二、球孢子菌 444

参考文献 446

附录一 培养细菌的常用培养基 447

附录二 几种常用的支原体培养基 453

附录三 分子生物学试验常用培养基及试剂 455

附录四 常用染色液 456

附录五 组织培养常用试剂 458

附录六 最大可能数表（MPN表） 460

附录七 免疫学实验常用试剂及配制方法 461

英汉对照表 466