实用重组DNA技术PDF电子书下载

第一章 基本技术 1

第一节 质粒DNA的快速制备方法 1

实验一 咸-表面活性剂法 1

实验二 煮沸法 7

第二节 利用氯化铯-溴化乙锭超速离心分离质粒DNA 9

第三节 采用Sepharose4B柱分离质粒DNA 12

第四节 凝胶电泳 16

实验一 水平型琼脂糖凝胶电泳 17

实验二 垂直型琼脂糖凝胶电泳 20

实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 21

实验四 微型凝胶电泳 23

第五节 DNA的溴化乙锭染色及染色DNA的确认 25

实验一 电泳后凝胶染色 26

实验二 在凝胶中预先加入溴化乙锭的方法 27

二、染色DNA的确认 27

第六节 凝胶中DNA的回收 28

实验一 电洗脱到DEAE（二乙氨基乙基纤维素）滤纸上的方法 28

实验二 电洗脱到凝胶凹槽的方法 30

实验三 冻结压榨法 31

实验四 醋酸铵法 32

实验五 透析袋法 33

实验六 玻璃粉洗脱法 35

第七节 DNA的纯化 36

实验一 DNA的精胺纯化法 37

实验二 用Nensorb柱纯化DNA 38

实验三 用Elutip柱纯化DNA 39

第八节 DNA的限制性内切酶酶切处理 40

第九节 核酸杂种的形成——遗传同源性的确定 45

实验一 Southern印迹法 47

实验二 菌落杂交法或斑点杂交法 53

第十节 DNA的标记 55

一、缺口平移法 56

实验一 利用大肠杆菌DNA聚合酶Iklenow片段或T4DNA多聚酶进行3＇-末端标记（添加反应或置换合成反应） 60

二、末端标记法 60

实验二 用末端脱氧核苷转移酶进行3＇-末端标记 64

实验三 5＇-末端标记法 65

三、非放射性探针 67

第十一节 放射自显影和X射线胶片显影 72

实验一 放射自显影 72

实验二 荧光显影 73

实验三 X射线胶片显影 74

第十二节 细菌的转化 74

一、直核细胞mRNA的制备与分离 77

第十三节 RNA实验方法 77

二、真核细胞总RNA的制备 80

实验一 异硫氰酸胍法制备总DNA 81

实验二 微量法制备RNA 82

三、互补链DNA（cDNA）的合成 83

四、变性凝胶的制备 86

实验一 加入氢氧化甲基汞的琼脂糖凝胶 87

实验二 加入甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶 87

实验三 加入7mol/L尿素的聚丙烯酰胺凝胶 88

五、Northern印迹法 89

实验一 用斑点印迹仪进行印迹分析 91

六、标记探针与RNA样品的斑点杂交法 91

实验二 不用斑点印迹仪进行印迹分析 93

第十四节 真核细胞DNA的制备 94

实验一 真核细胞DNA的快速制备方法 94

实验二 真核细胞DNA的一般制备方法 95

第十五节 DNA碱基序列的确定 97

实验一 Sanger法（双脱氧链终止法 98

实验二 Maxam-Gilbert法（化学法） 102

第一节 概述 106

一、M13载体 106

第二章 噬菌体的基因克隆 106

二、λ噬菌体载体 108

三、粘性质粒载体 111

第二节 噬菌体DNA的制备 111

一、噬菌体的噬菌斑纯化 111

二、噬菌体DNA的制备与纯化 113

第三节 λ噬菌体的基因克隆 116

一、噬菌体载体的制备 116

实验一 Charon28载体的制备 116

实验二 EMBL 3载体的制备 118

二、基因组DNA连接到噬菌体载体上并包装形成文库 120

三、文库的滴定与平板培养 126

四、利用放射性标记探针筛选文库 127

五、文库的扩增 130

第四节 cDNA克隆到λgt10和λgt11中 131

一、克隆载体的制备 131

实验一 λgt10克隆载体的制备 131

实验二 λgt11克隆载体的制备 133

二、cDNA文库连接和包装进λgt10或λgt11载体中 135

三、λgt10和λgt11包装插入物的接种与筛选 140

实验一 λgt10包装插入物的接种与筛选 140

实验二 λgt11包装插入物的接种与筛选 142

四、由λgt10和λgt11 cDNA克隆制备DNA 143

五、插入片段亚克隆到pBR322中 145

第五节 M13的基因克隆 147

一、M13载体的制备 147

二、插入物的制备 151

实验一 待分析DNA片段具有与M13克隆位点相匹配的酶切位点时的插入物制备 151

实验二 待分析DＮＡ片段末端与Ｍ１３克隆位点不相匹配时的插入物制备 151

三、插入物与载体的连接及重组体的转化 153

四、序列分析用单链M13 DNA的制备 155

第一节 载体一宿主系统 158

一、载体 158

第三章 原核细胞的基因克隆 158

二、宿主 164

第二节 大肠杆菌的基因克隆 165

一、质粒DNA的提取 165

二、基因克隆 166

实验一 利用限制性内切酶产生的粘性末端或平滑末端进行克隆 166

实验二 用碱性磷酸酶使质粒载体的再环化达到最低限度 169

实验三 同聚物加尾 172

实验四 用合成linker进行克隆 177

三、转化 180

四、cDNA文库的建立 182

第三节 枯草杆菌的基因克隆 187

一、DNA的提取 189

实验一 质粒DNA的提取 189

实验二 枯草杆菌染色体DNA的制备 190

二、利用质粒进行基因克隆 192

三、转化 193

实验一 感受态细胞转化 193

实验二 原生质体转化法 194

第四节 绿脓杆菌的基因克隆 195

一、质粒DNA的提取 198

实验一 利用氯化铯-溴化乙锭超速离心法制备中等大小的质粒DNA 198

实验二 质粒DNA的快速检出法 200

二、假单胞菌的转化 202

第五节 放线菌的基因克隆 204

一、转化 206

二、菌落杂交 208

第四章 酵母菌的基因克隆 210

第一节 DNA的分离方法 211

实验一 酵母总DNA的抽提 211

实验二 酿酒酵母共价闭合环状DNA的分离 212

实验三 自大肠杆菌中提取扩增的质粒DNA 214

一、克隆载体 216

第二节 酵母菌的克隆 216

二、载体构建 218

三、自我复制载体 221

四、2μm DNA载体 221

五、着丝粒载体 223

六、表达载体 224

七、LEU2基因的克隆 225

第三节 转化 226

一、宿主菌株 226

二、原生质体的使用 227

三、碱性阳离子的使用 230

第四节 克隆的选择 231

第五节 基因融合法 233

实验一 体内半乳糖激酶试验 236

实验二 体外半乳糖激酶试验 236

第五章 利用体外诱变制备突变株 239

第一节 缺失突变株 240

实验一 获得单纯缺失突变株的方法 241

实验二 生成微细缺失突变株的方法 245

第二节 插入突变株 250

实验一 部位特异性插入法 251

实验二 随机插入法 254

第三节 用合成寡脱氧核糖核苷导入点突变 258

一、DNA模板的制备 261

实验一 单链闭环DNA模板的制备 261

实验二 由双链重组质粒制备环状单链DNA模板 264

二、导入突变用寡脱氧核糖核苷特异性的确定 265

实验一 利用脉冲追踪起动方法加以确定 265

实验二 利用链终端法确定DNA碱基序列 268

三、杂环双链DNA的体外合成 272

四、杂环双链DNA的浓缩 274

实验一 通过S1核酸酶消化进行浓缩 274

实验二 利用碱-蔗糖密度梯度离心法进行浓缩 275

五、转染与转化 276

实验一 转染 277

实验二 转化 279

六、突变株的筛选 281

实验一 利用链终端法确定碱基序列 281

实验二 限制性内切酶酶切位点的筛选 282

实验三 通过杂交进行筛选 284

实验四 生物学方法筛选 286

附录 287

主要参考文献 296