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第一篇 概述 1

第一章 概况 3

1.1 转基因农作物发展概况 3

1.2 我国进口转基因农产品概况 3

1.3 我国进出境转基因产品检测体系建设 4

1.3.1 我国进出境转基因产品检测技术体系建设 4

1.3.2 我国进出境转基因产品检测标准体系建设 6

1.3.3 我国进出境转基因产品检测实验室体系建设 7

1.4 农产品转基因成分检测靶标分析 7

1.5 农产品转基因成分检测技术路线 11

第二章 农产品转基因成分检测技术 12

2.1 概况 12

2.2 基于核酸的检测技术 12

2.2.1 PCR 12

2.2.2 实时荧光PCR 13

2.2.3 PCR-DHPLC检测 13

2.2.4 基因芯片检测 14

2.2.5 生物传感器技术 14

2.3 基于外源蛋白的检测技术 15

第二篇 农产品转基因成分PCR-DHPLC检测 17

第三章 农产品转基因成分PCR-DHPLC引物设计 19

3.1 引物设计原理 19

3.2 设计的引物序列 19

第四章 农产品转基因成分单重PCR-DHPLC检测 23

4.1 材料、试剂与仪器 23

4.1.1 供试材料 23

4.1.2 实验试剂 24

4.1.3 引物序列 24

4.1.4 主要仪器设备 26

4.2 方法 26

4.2.1 DNA提取 26

4.2.2 PCR扩增 26

4.2.3 DHPLC检测 26

4.3 结果与分析 27

4.3.1 内源基因检测 27

4.3.2 筛查检测 28

4.3.3 外源功能基因检测 30

4.3.4 转基因品系检测 33

4.4 结论 49

第五章 农产品转基因成分多重PCR-DHPLC检测 50

5.1 材料、试剂与仪器 50

5.1.1 供试材料 50

5.1.2 实验试剂 50

5.1.3 引物序列 50

5.1.4 主要仪器设备 50

5.2 方法 50

5.2.1 DNA提取 50

5.2.2 PCR扩增 50

5.2.3 DHPLC检测 51

5.2.4 多重PCR-DHPLC特异性测定 51

5.2.5 多重PCR-DHPLC灵敏度测定 51

5.3 结果与分析 51

5.3.1 转基因大豆检测 51

5.3.2 转基因棉花检测 52

5.3.3 转基因玉米检测 55

5.3.4 转基因小麦检测 56

5.3.5 转基因油菜检测 57

5.4 结论 59

第六章 农产品转基因成分PCR-DHPLC试剂盒研制 60

6.1 转基因大豆DHPLC检测试剂盒研制 60

6.1.1 引物 60

6.1.2 反应体系 60

6.1.3 反应条件 61

6.1.4 试剂盒使用说明 61

6.2 转基因棉花DHPLC检测试剂盒研制 62

6.2.1 引物 62

6.2.2 反应体系 62

6.2.3 反应条件 63

6.2.4 试剂盒使用说明 63

6.3 转基因玉米DHPLC检测试剂盒研制 64

6.3.1 引物 65

6.3.2 反应体系 65

6.3.3 反应条件 65

6.3.4 试剂盒使用说明 65

6.4 转基因水稻DHPLC检测试剂盒研制 67

6.4.1 引物 67

6.4.2 反应体系 67

6.4.3 反应条件 67

6.4.4 试剂盒使用说明 67

6.5 转基因小麦DHPLC检测试剂盒研制 68

6.5.1 引物 68

6.5.2 反应体系的建立 69

6.5.3 反应条件 69

6.5.4 试剂盒使用说明 69

第三篇 农产品转基因成分可视芯片检测技术 71

第七章 农产品转基因成分可视芯片检测引物与探针设计 73

7.1 引物与探针设计原则 73

7.2 引物与探针设计方法 73

7.2.1 引物设计 73

7.2.2 探针设计 76

7.3 引物与探针设计结果 76

第八章 农产品转基因样品核酸制备 79

8.1 材料、试剂与仪器 79

8.1.1 供试材料 79

8.1.2 实验试剂 79

8.1.3 主要仪器设备 79

8.2 方法 79

8.2.1 样品保存 79

8.2.2 CTAB法提取微量转基因样品DNA 79

8.2.3 DNA浓度及纯度检测 80

8.2.4 内源基因扩增验证 80

8.3 结果与分析 80

8.3.1 基因组DNA提取 80

8.3.2 内源基因扩增验证 80

8.4 讨论 81

8.4.1 基因组DNA提取 81

8.4.2 内源基因扩增验证 82

第九章 引物、探针验证及光学薄膜生物传感器技术优化 83

9.1 材料、试剂与仪器 83

9.1.1 供试材料 83

9.1.2 实验试剂 83

9.1.3 主要仪器设备及耗材 83

9.2 方法 83

9.2.1 引物与探针保存 83

9.2.2 PCR扩增 84

9.2.3 点制探针芯片 84

9.2.4 基本步骤 84

9.2.5 技术优化 84

9.2.6 引物及探针有效性及特异性验证 84

9.3 结果 85

9.3.1 光学薄膜生物传感器芯片技术优化 85

9.3.2 引物与探针有效性及特异性验证 85

9.4 讨论 86

第十章 农产品转基因成分可视芯片—膜芯片检测技术 88

10.1 材料、试剂与仪器 88

10.1.1 材料 88

10.1.2 主要仪器设备 88

10.2 方法 88

10.2.1 转基因玉米品系或结构特异性检测 88

10.2.2 转基因木瓜、水稻、大豆外源DNA成分检测 88

10.2.3 转基因棉花及油菜八重PCR—可视芯片检测 90

10.3 结果与分析 90

10.3.1 转基因玉米PCR-光学薄膜生物传感器芯片检测 90

10.3.2 转基因木瓜、水稻、大豆外源DNA成分检测 92

10.3.3 转基因棉花及油菜八重PCR—光学薄膜生物传感器芯片检测 94

10.4 结论 95

第十一章 农产品转基因成分可视芯片-微孔板芯片检测技术 96

11.1 材料、试剂与仪器 96

11.1.1 供试材料 96

11.1.2 试剂 97

11.1.3 引物探针 97

11.1.4 主要仪器设备 99

11.2 方法 99

11.2.1 DNA提取 99

11.2.2 DNA浓度的测定 99

11.2.3 PCR扩增 99

11.2.4 芯片探针制备 100

11.2.5 杂交反应 100

11.3 结果与分析 100

11.3.1 特异性 100

11.3.2 灵敏度 101

11.4 结论 102

第十二章 转基因作物可视芯片检测试剂盒研制 104

12.1 DNA提取及纯度、浓度测定 104

12.2 引物探针设计 104

12.3 反应体系及条件 104

12.4 试剂盒说明 104

12.4.1 试剂盒组成 104

12.4.2 引物信息 105

12.4.3 检测芯片信息 105

12.5 使用方法 106

12.5.1 实验准备 106

12.5.2 实验步骤 106

12.5.3 结果判定 106

第四篇 农产品转基因成分固相芯片检测及定性定量PCR检测 109

第十三章 转基因大豆多重滚环扩增-基因芯片检测 111

13.1 材料 111

13.1.1 供试材料 111

13.1.2 主要试剂及仪器设备 111

13.2 方法 111

13.2.1 锁式探针设计 111

13.2.2 固相芯片点样 111

13.2.3 固相芯片点样及预处理 112

13.3 结果 112

第十四章 检疫性真菌、病毒和转基因成分多重滚环扩增-基因芯片检测 114

14.1 材料 114

14.1.1 供试真菌菌株 114

14.1.2 供试病毒毒株 117

14.2 方法 118

14.2.1 固相芯片点样 118

14.2.2 多重特异性测试 118

14.3 实验结果 119

第十五章 转基因水果常规PCR检测方法 120

15.1 材料、试剂与仪器 120

15.1.1 供试材料 120

15.1.2 实验试剂 120

15.1.3 主要仪器设备 121

15.2 方法 121

15.2.1 植物基因组DNA的提取 121

15.2.2 PCR检测 121

15.2.3 PCR产物片段克隆 122

15.3 结果与分析 123

15.3.1 DNA提取 123

15.3.2 插入外源基因表达结构 123

15.3.3 基因特异性PCR 124

15.3.4 基因特异性多重PCR 129

15.4 结论 130

第十六章 转基因水果实时荧光PCR检测方法 131

16.1 材料、试剂与仪器 131

16.1.1 供试材料 131

16.1.2 实验试剂 131

16.1.3 主要仪器设备 131

16.2 方法 131

16.2.1 引物探针 131

16.2.2 扩增 132

16.3 结果与分析 133

16.3.1 检测灵敏度 133

16.3.2 实时荧光PCR 134

16.3.3 双重荧光PCR检测转基因木瓜 140

16.4 结论 140

第十七章 转基因油菜品系检测 141

17.1 材料、试剂与仪器 141

17.1.1 供试材料 141

17.1.2 实验试剂 142

17.1.3 主要仪器设备 142

17.2 方法 142

17.2.1 参试样DNA提取、纯化和测定 142

17.2.2 DNA纯化 143

17.2.3 DNA浓度和纯度测定 143

17.2.4 引物设计 143

17.2.5 单重PCR检测体系和条件的建立 144

17.2.6 PCR产物鉴定 144

17.2.7 多重PCR检测体系和条件筛选 144

17.2.8 特异性检测 145

17.2.9 多重PCR灵敏度检测 145

17.2.10 重复性实验 145

17.3 结果与分析 145

17.3.1 单重PCR退火温度优化 145

17.3.2 PCR产物测序 145

17.3.3 多重PCR优化 147

17.3.4 单重PCR特异性 147

17.3.5 多重PCR特异性 150

17.3.6 多重PCR灵敏度 151

17.3.7 多重PCR的重复性检测 151

17.4 讨论 152

17.4.1 多重PCR检测的实用性 152

17.4.2 多重PCR结合其他检测技术在转基因检测中的运用 152

第十八章 转基因饲料检测方法研究 153

18.1 材料、试剂与仪器 153

18.1.1 供试材料 153

18.1.2 试剂 154

18.1.3 主要仪器设备 154

18.2 方法 154

18.2.1 DNA的抽提及浓度测定 154

18.2.2 定量PCR检测 155

18.2.3 PCR产物的凝胶电泳检测 157

18.2.4 Southern blot检测 157

18.2.5 DNA测序法 158

18.3 结果与分析 158

18.3.1 核酸制备 158

18.3.2 定量PCR 159

18.3.3 定性PCR扩增 165

18.3.4 Southern blot 168

18.3.5 测序 168

18.4 讨论与结论 169

18.4.1 讨论 169

18.4.2 结论 169

第十九章 转基因玉米和油菜品系数字PCR定量方法研究 171

19.1 前言 171

19.2 材料与方法 171

19.2.1 材料 171

19.2.2 实验方法 171

19.3 结果与分析 173

19.3.1 转基因玉米和油菜品系扩增稳定性结果 173

19.3.2 转基因玉米和油菜品系特异性扩增结果 182

19.3.3 转基因玉米和油菜品系的线性范围测定结果 189

19.3.4 转基因玉米和油菜品系的定量检测限和检测限结果 196

19.3.5 转基因玉米和油菜品系的精密度试验测定结果 200

19.4 结论 202

第五篇 农产品转基因成分溯源技术研究 205

第二十章 出口产品转基因成分溯源平台开发 207

20.1 RFID技术 207

20.2 基于RFID的出口产品转基因成分溯源系统构成 207

20.2.1 硬件构成 207

20.2.2 软件构成 208

20.3 结论 210

第二十一章 出口大米及米制品非转基因溯源技术测试 211

21.1 前言 211

21.2 硬件 211

21.3 测试方法 212

21.4 测试结果 214

21.5 结论 215

第二十二章 出口产品转基因成分溯源技术体系全程溯源示范 216

22.1 示范企业基地建设 216

22.1.1 江西某食品有限公司场地调查 216

22.1.2 某米业有限公司场地调查 216

22.1.3 硬件设备安装测试 216

22.1.4 软件安装调试 218

22.1.5 硬件软件培训 219

22.1.6 转基因管理制度建设 219

22.2 企业现场示范研究 220

22.2.1 江西某米粉厂现场示范研究 220

22.2.2 某米业有限公司现场示范研究 221

第六篇 农产品转基因成分检测计量与标准 223

第二十三章 转基因检测质粒阳性参考物质研制 225

23.1 材料、试剂与仪器 225

23.1.1 供试材料 225

23.1.2 实验试剂 226

23.1.3 引物序列 226

23.1.4 主要仪器设备 226

23.2 实验方法 226

23.2.1 DNA提取 226

23.2.2 PCR扩增 227

23.2.3 电泳 227

23.2.4 PCR产物纯化 227

23.2.5 连接T载体 227

23.2.6 转化感受态细胞 227

23.2.7 菌落PCR鉴定 227

23.2.8 提取质粒 228

23.2.9 克隆测序 228

23.2.10 序列分析 228

23.3 结果与分析 228

23.3.1 大豆相关克隆 228

23.3.2 棉花相关克隆 228

23.3.3 玉米相关克隆 229

23.3.4 水稻相关克隆 232

23.3.5 小麦相关克隆 233

23.4 结论 240

第二十四章 植物转基因产品检测计量标准资源整合与共享调查 241

24.1 调查方法 241

24.1.1 调查对象 241

24.1.2 调查时间 241

24.1.3 调查方式 241

24.1.4 调查内容 241

24.1.5 调查步骤 241

24.1.6 质量控制 242

24.1.7 数据处理和分析方法 242

24.2 结果 242

24.2.1 转基因产品检测计量标准资源 242

24.2.2 信息库的建设 243

24.2.3 实物库建设 243

24.3 讨论 243

第二十五章 转基因成分测量计量标准资源分类技术规范 244

25.1 前言 244

25.2 范围 244

25.3 引用文献 244

25.4 定义 244

25.5 转基因成分测量计量标准资源应符合的条件 246

25.6 转基因成分测量计量标准资源的分类 246

25.6.1 转基因成分测量参考标准资源 246

25.6.2 转基因成分测量参考方法资源 247

25.6.3 转基因成分检定规程资源 247

25.6.4 转基因成分检测技术规范资源 247

25.6.5 转基因产品管理和检测的政策法规 247

25.6.6 转基因成分检测的比对信息资源 247

25.6.7 转基因产品检测参考实验室资源 248

25.6.8 转基因成分检测人才信息资源 248

第二十六章 国内外转基因产品检测标准发展概况 249

26.1 转基因产品检测国际标准 249

26.2 转基因产品检测国外标准 250

26.3 转基因产品检测国家标准 252

26.4 转基因产品检测行业标准 253

26.4.1 国家质检总局进出境转基因产品检测行业标准 253

26.4.2 我国农业部门颁布的转基因产品检测行业标准 255

26.4.3 我国林业部门转基因产品检测行业标准 262

26.4.4 我国环保部门转基因产品检测行业标准 262

26.4.5 我国烟草部门转基因产品检测行业标准 263

26.5 结论与讨论 263

附录 研究所形成的标准 277

附录1 转基因产品检测 基因芯片检测方法 279

附录2 转基因玉米品系检测 可视芯片检测方法 295

附录3 植物性饲料中转基因成分PCR检测方法 300

附录4 转基因大豆DHPLC检测方法 308

附录5 转基因棉花DHPLC检测方法 312

附录6 转基因大米PCR-DHPLC检测方法 316

附录7 转基因玉米检测微滴式数字PCR定量方法 321

附录8 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米98140品系 326

附录9 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米DAS40278-9品系 331

附录10 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米VCO-01981-5品系 336

附录11 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米MON87427品系 341

附录12 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜73496品系 346

附录13 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜RF2品系 351

附录14 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜Topas19/2品系 356

附录15 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜T45品系 361

附录16 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜MON88302品系 366

附录17 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜OXY235品系 371

参考文献 376