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序1 1

序2 1

译者的话 1

前言 1

第一章 脱氧核糖核酸（DNA） 1

第一节 电泳 1

一、琼脂糖凝胶电泳 1

二、脉冲场凝胶电泳（PFGE） 4

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 9

四、变性梯度凝胶电泳（DGGE） 11

五、双向琼脂糖凝胶电泳 16

第二节 DNA定量分析 21

第三节 载体 23

一、质粒载体 23

二、酵母载体 26

（一）裂殖酵母载体 26

（二）酵母人工染色体（YAC）载体 31

三、逆转录病毒载体和基因转移 34

第四节 DNA克隆 44

一、载体的选择 44

（一）常用质粒载体 44

（二）特殊用途的质粒载体 45

二、PCR产物的TA克隆 46

三、基因组DNA文库的构建 49

四、DNA文库的筛选 57

五、cDNA杂交选择 60

六、应用PCR技术快速筛选克隆 72

第五节 DNA转化与转染 74

一、质粒DNA转化入细菌 74

（一）利用TSS缓冲液转化大肠杆菌 74

（二）用快速冷冻法转化大肠杆菌 75

（三）用氯化钙法进行感受态大肠杆菌的制备与转化 76

（四）假单孢细菌的转化 78

二、酵母DNA转化 79

（一）以球形体法为基础的裂殖酵母的转化方法 80

（二）醋酸锂法为基础的转化酵母的方法 82

三、哺乳动物细胞的DNA转染 84

（一）用磷酸钙法进行哺乳动物细胞的转染 84

（二）DEAE-Dextran转染法 87

（三）阳离子脂质体介导的转染 89

（四）脂质体介导的转染法 91

辅助方案：转染的甘油处理 92

辅助方案：用Hirt氏提取法抽提染色体外游离DNA 93

四、逆转录病毒介导的基因转移 95

一、在大肠杆菌中表达重组蛋白 99

第六节 基因表达与调控 99

二、利用杆状病毒在昆虫细胞中进行蛋白表达 104

三、外源DNA在蟾蜍卵及胚中的表达 113

四、VTF7-3株重组痘苗病毒在哺乳动物细胞中瞬时表达 122

五、反义技术 123

（一）寡聚脱氧核苷酸——合成的DNA或RNA 124

（二）反义RNA：从载体/cDNA克隆转录而来的反义RNA 130

（三）反义RNA或DNA转导靶细胞的方法 132

（四）反义DNA或RNA功能的检测 133

（一）细菌质粒DNA的小量制备 139

1.煮沸法 139

一、质粒DNA的提取 139

第七节 DNA的提取 139

2.碱裂解法 140

3.测序用质粒DNA的小量制备 142

4.单链质粒DNA的小量制备 144

5.质粒DNA的快速小量制备 145

6.不需要苯酚抽提的质粒DNA小量制备 147

7.丁香假单胞菌Pseudomonas syringae质粒DNA的小量制备 148

8.用商品化试剂盒小量制备质粒DNA 150

9.用瞬间小量制备试剂盒进行2min小量制备 152

1.碱裂解法大量制备质粒DNA 153

（二）细菌质粒DNA的大量制备 153

2.用PEG沉淀法进行质粒DNA大量制备 155

3.单链质粒DNA的大量制备 157

4.用氯化铯离心法大量制备质粒DNA 158

（三）酵母质粒DNA的分离 161

1.酵母质粒DNA的小量制备 162

2.酵母质粒DNA的大量制备 163

3.YAC DNA的分离 164

二、基因组或其他DNA的抽提 166

（一）哺乳动物细胞基因组DNA的抽提 166

（二）真核生物DNA的分离 169

（三）从植物中分离基因组DNA 173

（四）用CTAB抽提植物DNA 176

（五）从琼脂糖凝胶上分离DNA片段 179

（六）从琼脂糖凝胶上洗脱DNA片段 181

第八节 DNA的酶修饰 183

一、DNA聚合酶和聚合反应 183

二、用外切核酸酶Ⅱ产生单向缺失 185

三、用磷酸酶使DNA脱磷酸化 188

四、用多核苷酸激酶使DNA磷酸化 189

五、利用RNA酶处理制备不含RNA的DNA 191

六、DNA连接 192

七、用32P或生物素标记DNA探针 194

第九节 DNA检测与图谱分析 197

一、Southern杂交 197

二、快速Southern杂交法 197

三、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析 208

四、用聚合酶链式反应分析微卫星DNA遗传多态性 214

第十节 DNA序列分析 217

一、用Klenow酶进行双/单链DNA序列分析 217

二、用Taq?DNA聚合酶对RNA和cDNA进行序列分析 221

第十一节 突变 224

一、单向DNA缺失突变株的产生 224

二、寡聚核苷酸介导的克隆DNA的定点突变 234

辅助方案 237

方法1：如何制备辅助噬菌体R408 237

方法2：如何滴定噬菌体贮备液 238

方法3：快速制备少量质粒DNA以用于测序 239

第二章 核糖核酸（RNA） 242

第一节 RNA和凝胶电泳 242

一、RNA和无RNA酶的环境 242

二、RNA凝胶电泳 244

第二节 RNA的分离 248

一、RNA一步分离法 248

二、使用TRI REAGENT一步分离RNA 250

三、从大肠杆菌中分离RNA 251

四、用CsCl法从动物组织中分离RVA 252

五、用寡聚（dT）纤维素分离多聚（A）+RNA 254

六、从RNA表达载体中制备RNA转录物 256

第三节 RNA的合成和加工 261

一、RNA的化学合成 261

二、RNA标记 264

三、RNA测序 268

四、用催化性RNA切割RNA专一位点 272

五、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 274

六、竞争性RT-PCR 276

七、一步RT-PCR 281

八、信使RNA的差别显示 283

九、核的失控转录测定 291

十、RNA的体外剪接 295

第四节 RNA的检测和作图 297

一、Northern杂交 297

二、Northern杂交：一种快速方法 301

三、原位杂交 303

四、RNase A/T1保护和RNase H聚焦法 313

五、Fe(Ⅱ)-EDTA保护测定法 319

六、用引物延伸法进行RNA作图 320

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 325

第三章 蛋白质 325

第一节 蛋白质电泳 325

二、变性凝胶电泳（SDS-PAGE） 327

三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 333

四、琼脂糖凝胶免疫电泳 338

五、火箭电泳 341

六、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 342

七、染色凝胶中的蛋白 349

（一）考马斯亮蓝染色法 349

（二）银染法 351

（三）染色转印膜上的蛋白质 352

八、凝胶的干燥 354

第二节 蛋白质的提取与分离 355

一、条件培养基的制备 356

二、膜蛋白的提取 357

三、用于蛋白质检测的细胞裂解物的制备 358

第三节 蛋白质的检测和控制 360

一、酶联免疫吸附实验法（ELISA） 360

二、免疫沉淀法 363

三、蛋白质印迹法 366

四、增强化学发光蛋白免疫印迹法 368

五、蛋白质配基印迹法 370

六、配基和蛋白质间的亲合交联试验法 372

七、蛋白质和配基结合的免疫迁移移动测定法 374

八、以125I标记的底物电泳检测蛋白酶的活性 376

九、检测蛋白酶的酶谱法 379

十、流式细胞术中的细胞免疫染色 381

十一、细胞蛋白的标记 385

十二、微量蛋白质的自动氨基酸序列分析 387

第四章 计算机辅助技术 392

第一节 用于分子生物学的计算机程序 392

一、GCG软件包（Genetics Computer Group Package） 393

三、DNAStar-Lasergen 394

二、Mac Vector计算机序列分析软件 394

四、Primer Designer 395

五、Entrez Sequences and References 396

第二节 分子生物学中的计算机网络 398

一、GenBank Retrieval（基因库）检索和序列相似性搜寻 398

二、其他用于分子生物学的网络数据库或服务器 401

第三节 计算机网络中的生物信息 402

第四节 用GCG程序设计PCR引物 407

附录 417

供应商 423

名词 426

索引 433