分子克隆实验指南 第2版PDF电子书下载

中译本序 1

第一章 质粒载体 1

第一节 质粒的基本特性 1

（一）复制能力和不相容性 1

译者的话 3

（二）转移性 3

（三）选择标记 4

第二节 质粒载体 5

一、质粒克隆载体的发展 5

（一）可用组织化学方法鉴定重组克隆的质粒载体 6

（二）带有单链噬菌体复制起点的质粒载体 6

二、通常使用的质粒载体 7

（五）质粒表达载体 7

（四）可对重组克隆进行正选择的质粒载体 7

（三）带有噬菌体启动子的质粒载体 7

第二版前言 7

1.pBR322 8

2.pUC18、pUC19 8

鸣谢 9

3.pUC118、pUC119 9

4.pSP64、pSP65、pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4z 10

第一版前言 11

5.πN13 15

6.Bluescript M13+、M13- 15

第三节 质粒DNA的提取和纯化 16

一、导论 16

（一）细菌培养物的生长 17

（二）细菌的收获和裂解 17

（三）质粒DNA的纯化 18

2．碱裂解法 19

1．收获 19

二、质粒DNA的小量制备 19

（一）细菌的收获和裂解 19

3．煮沸裂解 22

（二）质粒DNA小量制备的问题与对策 23

（三）细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查 23

三、质粒DNA的大量制备 24

（一）在丰富培养基中扩增质粒 24

（二）细菌的收获和裂解 24

1．收获 24

2．煮沸裂解法 25

3．SDS裂解法 25

4．碱裂解法 26

（二）氯化绝-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA 28

1．连续梯度 28

四、质粒DNA的纯化 28

（一）聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA 28

2．不连续梯度 30

（三）从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭 31

1．方法Ⅰ：有机溶剂抽提 31

2．方法Ⅱ：离子交换层析 31

（四）溴化乙锭溶液的净化处理 32

1．溴化乙锭浓溶液（即浓度＞0.5mg/ml的溴化乙锭溶液）的净化处理 32

（五）从质粒DNA制品中去除RNA 33

2．溴化乙锭稀溶液（如含有0.5μg/ml溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理 33

1．通过1mol/L Nacl进行离心 34

2．通过Bio-Gel A-150m或Sepharose-CL 4B进行层析 34

第四节 在质粒载体中进行克隆的策略 34

一、连接反应的策略 35

（一）外源DNA片段末端的性质 35

1．带有非互补突出端的片段 35

2．带有相同末端（平端或粘端）的片段 37

（一）去磷酸化 40

二、线状质粒DNA的去磷酸化 40

3．带有平端的片段 40

（二）质粒载体和外源DNA中限制酶切位点的性质 40

（二）连接预试验和转化 41

三、连接反应 42

（一）外源DNA和质粒载体的连接反应 42

（二）粘端连接 46

（三）平端DNA连接 47

1．凝聚剂 47

（四）质粒载体中的快速克隆 48

第五节 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 49

（一）高压电穿孔法转化大肠杆菌（电转化法） 50

（二）方案一：制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞 50

（三）方案二：用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞 55

第六节 含重组质粒的细菌菌落的鉴定 56

（一）α互补现象的检查 57

一、小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析 57

二、α互补 57

三、插入失活 60

四、杂交筛选 60

（一）将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上 61

（二）将菌落影印在硝酸纤维素滤膜上 62

1．方法Ⅰ 62

2．方法Ⅱ 64

（三）菌落的裂解及DNA结合于硝酸纤维素滤膜 65

1．方法Ⅰ 65

2．方法Ⅱ 65

（四）与菌落的影印滤膜进行杂交 66

参考文献 69

（一）吸附 75

一、裂解周期 75

第一节 λ噬菌体的分子生物学 75

第二章 λ噬菌体载体 75

（二）立即早期转录 77

（三）延迟早期转录 77

（四）DNA复制 77

（五）晚期转录 77

（六）噬菌体的组装 79

（七）裂解 80

二、溶源状态 80

第二节 λ噬菌体载体 80

一、λ噬菌体载体的构建简史 80

二、选择适当的λ噬菌体载体 81

三、λ噬菌体载体的图谱 84

（一）Gharon 4A Charon 21A、Charon 32-35 和Charon 40载体 84

1．Charon 4A 86

2．Charon 21A 载体 88

3．Charon 32载体 90

4．Charon 33载体 92

5．Charon 34和Charon 35载体 94

6．Charon 40载体 98

（二）EMBL3、EMBL4和EMBL3A载体 100

（三）λ2001、λDASH和λFIX载体 102

1．λ2001载体 102

2．λDASH和λFIX载体 104

（四）λgt10载体 108

（五）λgt11和λgt18-23载体系列 108

1．λgt11载体 110

2．λgt18和λgt19载体 112

3．λgt20和λgt21载体 114

4．λgt22和λgt23载体 116

（六）λORF8载体 118

（七）λZAP载体 120

1．λZAP/R载体 122

四、选择适于λ噬菌体载体的宿主 123

（一）限制与修饰 123

（二）琥珀突变抑制基因 123

（三）重组系统 123

1．沉淀噬菌体颗粒 126

第三节 λ噬菌体的培养、纯化和DNA提取 127

一、λ噬菌体的噬斑纯化 127

（一）铺平板细菌的制备 127

（二）λ噬菌体的铺平板培养 127

（三）挑取λ噬菌体噬斑 128

二、从单斑制备λ噬菌体原种 129

（一）平板裂解物原种 129

1．平板表解物原种的制备：方法Ⅰ 129

2．平板裂解物原种的制备：方法Ⅱ 130

（二）小规模液体培养 131

（三）λ噬菌体原种的长期贮存 131

三、λ噬菌体的大规模制备 132

1．低复数感染法 132

2．高复数感染法 133

四、λ噬菌体的纯化 133

（一）λ噬菌体纯化的标准方法 133

（二）λ噬菌体纯化的其他方法 136

2．甘油分级梯度离心 136

3．氯化绝平衡离心 137

五、λ噬菌体DNA的提取 137

第四节 用λ噬菌体进行克隆 138

一、载体DNA的制备 138

（一）λ噬菌体DNA的限制酶切消化 139

1．蔗糖密度梯度离心 140

（二）λ噬菌体臂的纯化 140

2．氯化钠梯度离心 142

（三）用碱性磷酸酶处理的载体的制备 143

（四）λ噬菌体载体的双酶切消化 144

（五）λ噬菌体臂与外源DNA片段的连接 145

二、λ噬菌体DNA的体外包装 146

（一）λ噬菌体溶源状态的保持和检查 147

（二）包装提取物的制备和λ噬菌体DNA的体外包装 147

1．方法Ⅰ：用两个溶源菌制备包装提取物 149

2．方法Ⅰ：用两种提取物进行体外包装 151

3．方法Ⅱ：用一个溶源菌制备包装提取物 152

4．方法Ⅱ：用一种提取物进行体外包装 153

第五节 重组体的鉴定与分析 154

一、λ噬菌体噬斑原位杂交 154

（一）λ噬菌体噬斑在硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的固定 154

（二）λ噬随体噬斑的原位扩增及其在硝酸纤维素滤膜上的固定 156

（三）固定于硝酸纤维素滤膜的λ噬菌体噬斑的杂交 157

二、λ噬菌体分离物的快速分析 160

（一）平板裂解物法 160

（二）液体培养法 161

参考文献 163

第三章 粘粒载体 167

第一节 粘粒载体中的克隆 169

第二节 粘粒载体 170

一、用于在细菌中增殖真核DNA的粘粒载体 172

1．pJB8 172

2．c2RB 173

3．poos1EMBL 175

二、用于转染哺乳动物细胞的粘粒载体 176

1．pHC79-2cos/tk 176

2．pCV103、pCV107、pCV108 176

5．cos202、cos203 177

4．pHSG274 177

3．pTM、pMC、pNNl 177

6．pWE15、pWE16 178

7．卡隆粒9载体系列 179

第三节 应用粘粒载体构建基因组DNA文库 181

一、在磷酸酶处理过的粘粒载体中克隆 181

（一）载体DNA的制备 181

1．连接预试验 183

（二）用MboI或Sau3AI对真核DNA进行部分消化 184

（三）连接和包装 184

二、在经两种限制酶消化并经磷酸酶处理的粘粒载体中克隆 185

（一）载体DNA的制备 186

（二）用碱性磷酸酶处理真核DNA 187

（三）连接和包装 189

三、含有双cos位点的载体的制备 190

第四节 粘粒文库的扩增和贮存 191

（一）影印滤膜 192

（二）粘粒文库在液体培养中的扩增 194

（三）已包装粘粒的转导性裂解物的制备 195

第五节 应用粘粒时的常见问题 196

参考文献 198

第四章 单链丝状噬菌体载体 201

第一节 丝状噬菌体的生物学 202

第二节 丝状噬菌体载体 203

一、M13噬菌体载体 205

二、M13噬菌体载体的宿主菌 207

三、丝状噬菌体载体克隆中经常遇到的问题 212

四、噬菌粒：带有丝状噬菌体复制起点的质粒 212

（一）铺平板细菌的制备 215

一、M13噬菌体的噬斑纯化 215

（二）用M13噬菌体铺平板 215

五、重组丝状噬菌体与噬菌粒所产生的单链DNA的用途 215

第三节 M13噬菌体的繁殖及其DNA的制备 215

（三）挑取M13噬斑 217

二、利用单个M13噬斑制备噬菌体原种 217

（一）液体培养 217

三、M13噬菌体DNA的制备 218

（一）M13噬菌体复制型DNA的小规模制备 218

（二）M13噬菌体单链DNA的小规模制备 220

（四）M13噬菌体单链DNA的大规模制备 221

（三）M13噬菌体复制型双链DNA的大规模制备 221

第四节 M13噬菌体克隆及感受态细菌的转染 222

（一）外源DNA在M13噬菌体载体的克隆 223

（二）感受态细菌的制备 224

（三）用M13噬菌体转染感受态细菌 224

第五节 重组体的鉴定与分析 225

（一）直接电冰 225

（三）小规模制备的M13噬菌体复制型DNA的分析 226

（二）M13噬菌体的噬斑原位杂交 226

（四）重组M13噬菌体中外源DNA插入方向的鉴定 227

第六节 噬菌粒克隆 228

（一）M13KO7的培养 230

（二）单链噬菌粒DNA的制备 230

（三）利用超感染法筛选菌落 231

参考文献 233

第五章 分子克隆中所用的酶 237

第一节 限制酶和DNA甲基化酶 237

一、限制酶产生的末端的连接 237

（一）匹配粘端 237

（二）平端 243

（三）不匹配的粘端 244

二、同裂酶 246

3．大肠杆菌中依赖于甲基化酶的系统 247

2．dcnt甲基化酶 247

1．dum甲基化酶 247

三、DNA的甲基化作用 247

（一）大肠杆菌常用菌株的甲基化作用 247

4．大肠杆菌M. EcoRI甲基化酶 255

（二）通过DNA甲基化作用对限制酶切位点进行修饰 255

（三）甲基化对DNA限制酶切图的影响 257

四、利用限制酶对DNA进行消化 259

（一）限制酶消化反应的进行 259

第二节 分子克隆中常用的其他酶 262

一、DNA聚合酶 262

（一）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） 264

1．用途 264

2．反应例解 265

（二）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） 267

1．用途 267

2．反应例解 268

1．用途 270

（三）T4噬菌体DNA聚合酶 270

2．反应例解 271

（四）T7噬菌体DNA聚合酶 273

1．用途 273

（五）经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶） 274

（六）Taq DNA聚合酶及AmpliTaqTM DNA聚合酶 274

1．用途 274

2．反应例解 275

（七）反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶） 275

1．用途 276

2．反应例解 277

（八）末端转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶） 278

1．用途 278

1．用途 279

（一）SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶 279

二、依赖于DNA的RNA聚合酶 279

2．反应例解 279

2．反应例解 280

三、连接酶、激酶及磷酸酶 280

（一）T4噬菌体DNA连接酶 282

1．用途 282

2．反应例解 282

（二）大肠杆菌DNA连接酶 283

1．反应例解 283

（三）T4噬菌体RNA连接酶 284

1．用途 284

2．反应例解 284

（四）T4噬菌体多核苷酸激酶 284

1．用途 285

2．反应例解 285

1．用途 286

（五）碱性磷酸酶 286

2．反应例解 287

四、核酸酶 287

（一）BAL 31核酸酶 287

1．用途 287

2．反应例解 289

（二）S1核酸酶 291

1．用途 291

2．反应例解 291

（三）绿豆核酸酶 291

1．用途 292

（四）核糖核酸酶A 292

1．用途 292

（五）核糖核酸酶T1 292

（六）脱氧核糖核酸酶Ⅰ 293

1．用途 293

1．用途 293

1．用途 294

2．反应例解 294

（八）λ噬菌体外切核酸酶 295

1．用途 295

2．反应例解 295

第三节 DNA结合蛋白 296

（一）单链DNA结合蛋白（SSB） 296

1．用途 296

（二）RecA蛋白 296

1．用途 296

（三）拓扑异构酶Ⅰ 297

参考文献 298

一、概述 304

第一节 琼脂糖凝胶电泳 304

第六章 DNA的凝胶电泳 304

（一）影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率的因素 305

1．DNA的分子大小 305

2．琼脂糖浓度 306

3．DNA的构象 306

4．所加电压 306

5．电场方向 307

6．碱基组成与温度 307

7．嵌入染料的存在 307

8．电泳缓冲液的组成 307

（二）琼脂糖凝胶电泳装置 308

二、琼脂糖凝胶的制备和检查 309

（一）琼脂糖凝胶的制备 309

（二）微型凝胶 313

（四）溴化乙锭溶液的净化处理 314

1．溴化乙锭浓溶液（即浓度＞0.5mg/ml的溴化乙锭溶液）的净化处理 314

（三）琼脂糖凝胶中DNA的染色 314

2．溴化乙锭稀溶液（如含有0.5μg/ml 溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理 315

（五）摄影 315

（六）碱性琼脂糖凝胶电泳 316

三、琼脂糖电泳分离的DNA的回收及纯化 318

（一）DEAE-纤维素膜的电泳回收法 319

（二）透析袋电洗脱法 321

（三）从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 322

（四）纯化从琼脂糖凝胶中回收的DNA 323

1．DEAE-Sephacel柱层析法 323

2．有机溶剂抽提法 324

第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 325

一、非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备 327

二、聚丙烯酰胺凝胶中DNA的检测 330

（一）溴化乙锭染色 330

2．固定的干凝胶 331

1．未固定的湿凝胶 331

（二）放射自显影 331

三、从聚丙烯酰胺凝胶中分离DNA片段 332

（一）“压碎与浸泡”法 332

第三节 其他类型的凝胶 333

一、链分离凝胶 333

二、变性梯度聚丙烯酰胺凝胶 333

三、脉冲电场凝胶电泳 334

（一）装置的设计 334

（二）脉冲电场凝胶电泳所分离DNA的染色 335

（三）用于脉冲电场凝胶电泳的DNA的制备 336

1．从哺乳动物细胞中分离完整的DNA 336

2．从酵母中分离完整的DNA 337

3．琼脂糖凝胶块中的DNA的限制酶消化 338

（四）脉冲电场凝胶电泳的标准参照物 338

参考文献 340

（一）实验程序 343

一、控制RNA酶的活性 343

第七章 真核细胞mRNA的提取、纯化及分析 343

第一节 RNA的提取和纯化 343

（二）RNA酶的抑制剂 344

（三）破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法 345

二、RNA的分离 345

（一）哺乳动物细胞总RNA的分离 345

（二）哺乳动物细胞总RNA的快速分离 348

（三）哺乳动物细胞胞质RNA的分离 349

（四）卵和胚胎细胞总RNA的分离 351

（五）用强烈变性剂提取总RNA 352

1．通过硫氰酸胍提取和氯化铯离心制备RNA 352

2．用盐酸胍和有机溶剂提取RNA 355

三、带poly (A)的RNA 的分离 356

四、在氢氧化甲基汞存在下进行RNA分级分离 359

（一）在含有氢氧化甲基汞的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳 359

1．从含有氢氧化甲基汞的琼脂糖凝胶中回收RNA 360

（二）通过氢氧化甲基汞-蔗糖梯度离心对RNA进行分级分离 361

第二节 RNA的分析 362

一、N orthen杂交 363

（一）经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的RNA电泳 364

（二）在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳 366

（三）将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜 367

（四）变性RNA转移至尼龙膜 369

（五）在转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的RNA染色 370

1．方法Ⅰ 370

2．方法Ⅱ 371

（六）杂交和放射自显影 371

二、RNA的斑点和狭线杂交 372

（一）RNA的狭线杂交 372

（二）细胞质RNA的狭线杂交 373

三、RNA的S1核酸酶作图 374

（一）用S1核酸酶和双链DNA探针进行RNA作图 377

（二）用S1核酸酶和单链DNA探针进行RNA作图 380

四、用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针进行RNA作图 383

五、用引物延伸法进行RNA的分析 388

参考文献 392

第八章 cDNA文库的构建和分析 396

第一节 cDNA克隆的策略 396

一、制备用于cDNA克隆的mRNA 396

（一）mRNA的来源 396

（二）mRNA的完整性 397

（三）高丰度RNA 398

（四）低丰度mRNA 399

（五）富集方法 399

1．按大小对mRNA进行分级分离 400

2．CDNA的分级分离 400

二、cDNA第一链的合成 401

3．多聚核糖体的免疫学纯化法 401

三、cDNA第二链的合成 403

（一）自身引导法 403

（二）cDNA第二链的置换合成法 404

（三）cDNA第二链的引导合成 405

四、双链cDNA的分子克隆 408

（一）同聚物加尾 408

（二）合成的DNA接头和衔接头 411

（三）克隆cDNA的其他方法 414

1．mRNA-cDNA克隆 414

2．依次连加不同接头 414

3．在Okayama-Berg 载体中克隆cDNA 414

4．利用引物一衔接头克隆cDNA 416

5．在单链载体中克隆cDNA 417

五、用于cDNA克隆的λ噬菌体载体 418

1．λgt10 419

（一）λ噬菌体载体λgt 10和λgt11 419

2．λgt11 420

（二）其他用于cDNA克隆的λ噬菌体载体 422

1．λORF8 422

2．λgt18、λgt19 424

3．λgt20、λgt21 425

4．λgt22、λgt23 425

5．λZAP 427

六、目的cDNA克隆的鉴定 428

（一）筛选方法 428

1．核？杂文 428

2．特异性抗原的免疫学检测 430

3．cDNA克隆的同胞选择 431

（二）确证cDNA克隆的方法 431

第二节 cDNA克隆的操作流程 432

（一）注意事项 433

一、在λ噬菌体中构建cDNA文库 433

（二）cDNA第一链的合成程序 437

（三）cDNA第二链的合成程序 440

（四）cDNA的甲基化 441

（五）与合成的磷酸化接头相连接 442

（六）cDNA的大小选择 444

（七）与λ噬菌体臂连接 445

（八）cDNA插入片段的分析 447

（九）完整cDNA文库的生成 448

（十）cDNA文库的扩增 448

1．扩增构建于λgt10噬菌体文库：筛除亲本噬菌体 448

2．扩增构建于λgt11噬菌体及其衍生载体和λZAP或λZAPⅡ中的文库 448

二、克隆cDNA时常见的问题 449

参考文献 451

第九章 真核基因组DNA的分析和克隆 456

（一）λ噬菌体和粘粒载体 457

第一节 用于构建真核基因组DNA文库的载体 457

一、引言 457

（二）酵母人工染色体系统 458

二、可用于构建真核基因组DNA文库的λ噬菌体载体 459

三、用于构建真核基因组DNA文库的粘粒载体 463

第二节 从哺乳动物细胞中分离高分子量DNA 463

（一）从哺乳动物细胞中分离DNA：方案一 464

（二）从哺乳动物细胞中分离DNA：方案二 467

（三）从哺乳动物细胞中分离DNA：方案三 468

第三节 高分子量真核DNA的限制酶部分消化 469

（一）预试验 469

（二）DNA部分消化物的大规模制备 471

（三）基因组DNA片段3′凹端的不完全补平 472

（四）基因组DNA文库的扩增 473

一、琼脂糖凝胶电泳分离哺乳动物基因组DNA的限制酶切片段 474

第四节 基因组DNA的Southern杂交分析 474

二、将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持体上 475

（一）将DNA转移至硝酸纤维素滤膜 478

1．DNA向硝酸纤维素滤膜的毛细管转移 478

2．DNA从一块凝胶同时向两张硝酸纤维素滤膜转移 479

（二）DNA从凝胶转移至尼龙膜 480

1．DNA在中性条件下向尼龙膜的毛细管转移 481

2．DNA在碱性条件下向尼龙膜的毛细管转移 481

三、放射性标记的探针与固定化的核酸杂交 483

（一）放射性标记的探针与固定于硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上的核酸进行杂交 486

（二）放射性标记的寡核苷酸与基因组DNA进行杂交 489

（三）从硝酸纤维素滤膜和尼龙膜上除去放射性标记的探针 490

1．从硝酸纤维素滤膜上除去探针 490

2．从尼龙膜上除去探针 490

参考文献 491

第十章 放射性标记DNA探针与RNA探针的制备 495

第一节 均一标记的DNA探针的合成 498

一、DNA的切口平移 498

（一）切口平移贮存液 498

（二）切口平移的操作步骤 499

（三）另一种切口平移方法的操作步骤 501

二、用随机寡核苷酸引物合成均一标记的DNA探针 502

（一）利用变性的双链DNA合成探针 503

1．利用引物延伸法合成放射性标记探针 503

2．在熔化琼脂糖存在下进行DNA的放射性标记 504

第二节 单链探针的制备 505

一、用M13噬菌体载体合成单链DNA探针 506

（一）引物：模板的比例与核苷酸的浓度 506

（二）单链DNA探针的合成 507

（三）Sepharose CL-4B碱性柱层析分离小（＜150核苷酸）探针 509

（四）疑难解答 509

二、用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶以及双链DNA为模板体外转录合成RNA探针 510

（一）可供制备RNA探针的质粒载体 511

（二）DNA模板的制备 512

（三）RNA体外合成 512

（四）高比活度放射性RNA探针的合成 513

（五）疑难解答 515

三、 cDNA探针的合成 516

（一）cDNA克隆的鉴定 516

1．差示筛选 516

2．吸收探针 517

3．扣除文库 519

4．高比活度标记的扣除探针 519

（二）以寡核苷酸作探针合成与单链RNA互补的总cDNA探针 520

（三）用oligo（dT）作引物合成放射性标记的扣除cDNA探针 522

（四）高比活度扣除探针的合成 523

一、用大肠杆菌DNA聚合酶I的K lenow片段标记双链DNA的3′端 525

第三节 DNA的5′或3′末端标记 525

二、用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3′端 527

（一）DNA的快速末端标记 527

（二）置换合成 529

三、用T4噬菌体多核苷酸激酶标记DNA的5′端 530

（一）正向反应 530

1．以带5′突出端的DNA分子作底物 530

2．以带平端成5′凹端的DNA分子作底物 532

3．DNA的去磷酸化 532

（二）交换反应 533

1．以带5′磷酸突出端的DNA分子作模板 533

参考文献 535

第十一章 合成寡核苷酸探针 538

第一节 寡核苷酸探针的类型和应用 538

一、特定序列的单一寡核苷酸 538

二、较短而简并性较高的成套寡核苷酸 539

（一）寡核苷酸长度和简并性对杂交特异性的影响 540

（二）较短而简并性较高的成套寡核苷酸的设计 542

三、较长而简并性较低的成套寡核苷酸 543

（一）猜测体 543

1．猜测体的设计 545

2．猜测体的标记 546

（二）在具有简并性的位置上带有一个中性碱基的寡核苷酸 546

第二节 合成寡核苷酸的纯化和放射性标记 549

一、合成寡核苷酸的纯化 549

（一）合成寡核苷酸的精制 550

（二）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法回收寡核苷酸 551

（三）硅胶反相层析法分离寡核苷酸 555

二、通过T4噬菌体多核苷酸激酶催化的磷酸化反应标记合成的寡核苷酸 556

（二）乙醇沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸 558

（三）CPB沉淀法纯化放射性标记的寡核苷酸 558

（一）概述 558

三、放射性标记的合成寡核苷酸的纯化 558

（四）Bio-Gel P-60层析法纯化放射性标记的寡核苷酸 560

（五）Sep-Pak C18柱层析法纯化放射性标记的寡核苷酸 561

四、用大肠杆菌DNA聚合酶Iklenow片段标记合成的寡核苷酸 562

第三节 寡核苷酸探针的杂交条件 565

一、引言 565

二、寡核苷酸与靶序列的完全配对杂交体解链温度的计算 565

三、对碱基错配所发生影响的估计 566

四、成套寡核苷酶的杂交 566

（一）概述 566

（二）含有烷基季铵盐的溶剂的配制和使用 567

五、猜测体杂交 568

六、在简并位置上带有中性碱基的寡核苷酸的杂交 569

七、根据实验确定解链温度 569

参考文献 572

第十二章 利用抗体和寡核苷酸筛选表达文库 576

第一节 利用质粒和λ噬菌体载体构建表达文库 577

（一）质粒和λ噬菌体表达载体的相对优越性 577

（二）基因组DNA和cDNA表达文库 578

（三）构建于质粒的表达文库 579

（四）构建于λ噬菌体的表达文库 580

第二节 抗体在免疫学筛选中的应用 581

（一）抗体的选择 581

（二）抗血清的纯化 582

（三）大肠杆菌表达蛋白所结合的抗体的检测方法 582

（四）免疫学筛选结果的确证 583

第三节 表达文库的免疫学筛选 583

一、筛选构建于λ噬菌体载体的表达文库 583

二、菌落筛选 587

（一）制备用于筛选的菌落 587

1．方法Ⅰ 587

2．方法Ⅱ 588

（二）菌落免疫学筛选中滤膜的处理 589

三、假筛选法去除抗大肠杆菌抗体 590

四、制备大肠杆菌裂解液用于吸收抗大肠杆菌抗体 590

五、亲和层析法去除抗大肠杆菌抗体 590

六、免疫球蛋白G的放射性碘化 591

第四节 利用合成寡核苷酸筛选构建于λ噬菌体的cDNA文库 592

（一）放射性标记多联体探针的制备 593

（二）通过放射性标记多联体探针进行筛选时滤膜的制备 594

（三）用放射性标记DNA探测固定化蛋白质 595

（四）制备含有由λgt11噬菌体溶源菌所编码的融合蛋白的裂解液 595

参考文献 598

第十三章 DNA序列测定 602

第一节 序列测定的技术和策略 602

一、Sanger 双脱氧链终止法 602

2．模板 603

3．DNA聚合酶 603

1．引物 603

（一）Sanger法DNA测序的试剂 603

4．放射性标记的dNTP 607

5．dNTP类似物 607

二、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 608

三、测序策略 610

（一）确证性测序 610

（二）从头测序 610

1．选择随机或定向测序策略的影响因素 611

第二节 随机测序 615

一、建立随机重叠克隆的文库 616

（一）靶 DNA的纯化和连接 616

（二）靶DAN的断裂 618

1．超声处理 618

2．在锰离子存在下进行的DNA酶I消化 619

（四）载体DNA的制备 620

（三）DNA的修补及大小选择 620

（五）与载体DNA连接 621

第三节 定向测序 622

一、生成若干套嵌套的缺失突变体 622

（一）利用外切核酸酶Ⅲ生成嵌套的缺失突变体 626

第四节 Sanger双脱氧链终止法测序 629

一、设立双脱氧测序反应 629

（一）单链DNA的制备 629

（二）引物的制备 629

（三）微量滴定板 629

（四）链延伸一链终止反应混合液 630

1．DNTP和ddNTP贮存液 630

二、变性聚丙烯酰胺凝胶 631

（一）配制缓冲液梯度的聚丙烯酰胺凝胶 632

（二）梯度测序凝胶的加样和电泳 637

（三）测序凝胶的放射自显影 639

（四）从凝胶上读取DNA序列 640

三、应用大肠杆菌DNA聚合酶|Klenow片段的双脱氧测序反应 641

（一）准备工作 641

1．dNTP使用液的配制 641

2．ddNTP使用液的配制 641

（二）测序反应 642

四、应用测序酶的双脱氧测序反应 644

（一）准备工作 645

（二）测序反应 645

五、测定变性双链DNA模板的序列 647

（一）测定经CsCl-溴化乙锭梯度平衡离心纯化的质粒DNA的序列 648

（二）通过氯化锂沉淀从小量制备的质粒DNA中除去RNA 649

六、双脱氧测序中出现的问题 649

（一）模板特异的问题 649

（三）聚丙烯酰胺凝胶出现的问题 650

（二）全局性问题 650

第五节 Maxam-Gilbert法测序 653

一、概论 653

（一）靶DNA的不对称标记 653

（二）制备靶DNA以供Maxam-Gilbert法测序 657

（三）试剂、溶液和装置 657

二、传统Maxam-Gilbert测序法 660

（一）在G残基上的裂解 660

（二）在嘌呤（A+G）残基上的裂解 661

（三）在嘧啶残基上的裂解（C+T） 661

（四）在C残基上的裂解 661

（五）在A和C残基上的裂解（A＞C） 662

（六）用哌啶处理样品 662

四、Maxam-Gilbert测序法疑难问题解答 663

（一）阅读测序凝胶 663

三、另一种Maxam-Gilbert测序法 663

（二）常见问题 665

第十四章 聚合酶链式反应体外扩增DNA 672

一、PCR扩增技术的应用 674

（一）生成克隆化双链DNA中的特定序列作为探针 674

（二）选择性扩增特定DNA区段以生成非克隆化基因的特异性探针 675

（三）从少量mRNA生成cDNA文库 676

（四）生成大量DNA以进行序列测定 676

（五）突变的分析 677

（六）染色体缓移 677

二、扩增的方法 679

（一）注意事项 679

（二）PCR反应系统的组成 680

1．寡核苷酸 680

2．用于PCR的缓冲液 680

（三）扩增反应 681

5．靶序列 681

4．脱氧核苷三磷酸 681

3．TaqDNA聚合酶 681

（四）扩增由mRNA反转录而成的cDNA 683

三、Sanger双脱氧链终止法测定DNA扩增产物的序列 684

（一）方案一：利用放射性标记的寡核苷酸引物测定DNA扩增产物的序列 684

1．通过离心透析去除DNA扩增产物中的寡核苷酸及过多的dNTP 684

2．寡核苷酸测序引物的放射性标记 685

3．退火 686

（二）方案二：测定由不对称扩增反应所生成单链DNA模板的序列 687

四、靶序列初始浓度的定量分析 688

参考文献 691

第十五章 克隆化DNA的定点诱变 693

第一节 缺失与插入的形成 693

一、简单的缺失或插入 693

二、系统缺失和插入 694

（一）插入接头的诱变 694

1．利用切点频繁出现的限制酶产生插入接头的突变体 696

参考文献 699

（二）若干套嵌套的缺失突变体的产生 700

1．利用BAL 31核酸酶消化法产生若干套双向的缺失突变体 705

2．在Mn2+存在下用胰DNA酶I切割双链闭环DNA 709

（三）接头分区诱变 712

1．带BglⅡ接头及kanr基因的靶片段的分离 716

2．靶 DNA片段的回收 721

3．靶DNA的切出 722

4．分析在靶区域中含有BglⅡ接头的克隆 723

第二节 寡核苷酸介导的诱变 724

一、概述 724

（一）单链模板DNA的制备 725

（二）诱变寡核苷酸的设计和挑选 726

（三）寡核苷酸与模板DNA的杂交和引物延伸 727

（五）突变DNA片段的回收 729

（四）大肠杆菌的转染及突变体的筛选 729

（六）提高诱变效率的若干方法 730

二、双引物诱变法 731

三、利用标记寡核苷酸对噬斑和菌落进行杂交筛选 733

（一）通过磷酸化反应对寡核苷酸进行放射性标记 733

（二）利用放射性标记的寡核苷酸对M13噬菌体噬斑进行杂交筛选 734

（三）利用放射性标记的寡核苷酸对细菌菌落进行杂交筛选 736

四、通过筛除带尿嘧啶的模板链进行诱变（Kunkel法） 737

（一）带尿嘧啶的单链DNA的制备 738

五、疑难解答 741

第三节 通过诱变研究蛋白质 741

一、在蛋白质编码区插入六聚体接头 743

（一）六聚体接头的设计 744

（二）六聚体接头的插入 745

二、在特定的DNA区段上产生许多突变 749

（一）成套的简并的诱变寡核苷酸的应用 750

（二）用化学诱变剂处理双链DNA 757

（三）用亚硫酸氢钠处理单链DNA 758

（四）用损伤所有4种碱基的化学药品处理单链DNA 758

（五）DNA聚合酶催化的核苷酸错掺 758

参考文献 760

第十六章 克隆化基因在哺乳动物培养细胞中的表达 765

第一节 蛋白质的表达 765

一、从克隆化基因表达蛋白质 765

二、哺乳动物细胞表达载体的功能元件 766

（一）便于在细菌中构建、增殖与扩增重组载体的原核质粒序列 767

（二）由表达外源DNA序列所必需的所有元件组成的真核表达组件 767

1．启动子和增强子元件 767

2．终止信号和加poly（A）信号 768

3．剪接信号 768

4．用于复制和选择的元件 769

（三）外源DNA序列 775

三、载体系统 776

（一）不带真核复制子的质粒型载体 776

（二）带真核病素调控序列元件的质粒表达载体 776

1．SV40载体 776

2．牛乳头瘤病毒载体 781

3．Epstein-Barr病毒载体 783

（三）扩增系统 785

第二节 重组载体导入哺乳动物细胞 786

一、磷酸钙和DNA共沉淀物的传染 787

（一）磷酸钙介导的贴壁细胞的通用转染方法 788

（二）磷酸钙介导的贴壁细胞悬浮转染法 791

（三）磷酸钙介导的悬浮培养细胞转染法 791

（四）改进的磷酸钙介导细胞转染法 792

二、DEAE—葡聚糖介导的转染 793

（一）利用DEAE—葡聚糖的转染：方法一 794

（二）利用DEAE—葡聚糖的转染：方法二 795

三、利用Polybrene的DNA转染 797

四、利用原生质体融合的DNA转染 798

（一）原生质体制备 798

（二）原生质体与哺乳动物贴壁细胞的融合 799

（三）原生质体与悬浮生长的哺乳动物细胞的融合 800

五、电穿孔法DNA转染 801

第三节 研究基因调控的策略 802

一、带报道基因的载体 803

二、氯霉素乙酰转移酶和β—半乳糖苷酶活性的测定 804

（一）提取物的制备 804

（二）氯霉素乙酰转移酶的测定 805

1．方法Ⅰ：薄层层析法 805

2．方法Ⅱ：有机溶剂抽提法 806

3．方法Ⅲ：反应产物的闪烁液扩散法 807

（三）哺乳动物细胞提取物中β—半乳糖苷酶的测定 808

第四节 哺乳动物细胞中的表达克隆 809

（一）通过cDNA的表达进行克隆 809

（二）基因组DNA的表达克隆 810

参考文献 813

第十七章 克隆化基因在大肠杆菌中的表达 822

第一节 融合蛋白的产生 822

（一）表达IacZ融合基因的载体系统 823

（二）表达质粒的构建和融合蛋白的检测 825

（三）制备融合蛋白用于诱导抗体产生 826

第二节 完整天然蛋白的产生 827

一、原核基因的表达：启动子 827

（一）λ噬菌体PL启动子 827

（二）trp-lac启动子 828

（三）T7噬菌体启动子 829

二、真核基因的表达：启动子和核糖体结合位点 831

（一）制备DNA片段以插入功能性核糖体结合位点的附近 832

1．编码蛋白质氨基酸的DNA的合成 832

2．引物修补 832

3．限制酶切位点的改造 833

（二）利用所制备的片段进行基因表达 838

三、其他表达系统 839

（一）可用蛋白酶或溴化氰裂解的融合蛋白的表达 840

1．合成可被因子Xa切割的杂合蛋白 841

（二）外源蛋白的分泌型表达 841

1．由phoA介导的表达与分泌 842

四、克隆化基因表达水平的定量 843

（一）利用β—半乳糖苷酸活性进行表达检测 844

五、克隆化基因表达水平的提高 844

六、蛋白质纯化 845

（一）包涵体 845

2．包涵体的洗涤与纯化 846

1．细胞的裂解 846

（二）包涵体的溶解 847

参考文献 849

第十八章 克隆化基因所表达蛋白质的检测与分析 852

第一节 抗体的产生 852

（一）免疫应答的影响因素 853

1．动物种类 853

2．遗传因素 853

3．抗原的物理状态 853

4．抗原的用量 854

5．注射途径 854

6．免疫程序 854

（二）使用小量抗原进行免疫的方法 855

（三）单克隆抗体 855

1．合成肽与匙孔？血蓝蛋白的偶联 856

（四）抗合成肽抗血清的制备 856

（五）抗血清的收集与保存 857

第二节 抗体的纯化 858

一、A蛋白吸附法纯化抗体 858

二、吸附法纯化抗体 859

（一）从抗血清中去除交叉反应性抗体 860

（二）特异性抗体的纯化 860

1．利用固定于硝酸纤维素滤膜上的抗原亲和纯化单特异性抗体 861

第三节 免疫学测定 862

一、固相放射免疫测定 862

（一）用两种抗体作固相放射免疫分析 863

（二）抗体的碘化 865

1．用氯胺T法对抗体进行放射性碘化 866

二、免疫沉淀法 867

（一）靶蛋白的放射性标记 867

1．用[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸标记哺乳动物细胞 868

2．通过体内代谢途径对酵母和细菌表达的蛋白质进行放射性标记 869

（二）细胞的裂解 870

1．哺乳动物培养细胞的裂解 873

2．酵母的机械破碎法 873

3．酵母的酶裂解法 874

4．快速裂解酵母细胞 875

5．细菌的裂解 876

（三）抗原-抗体复合物的形成 877

1．细胞裂解液的预清除 878

（四）靶蛋白的免疫沉淀 879

（五）蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 880

1．SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制 881

2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的？制 882

3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 885

4．用银盐对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 886

5．SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥 887

三、蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体：固定化蛋白质的免疫学测定（Western印迹法） 888

（一）样品的制备和电泳 889

1．用凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织 889

（二）蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体 891

（三）对固定于硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色 893

1．丽春红S染色 893

2．用印度墨汁染色 894

（四）封闭硝酸纤维素滤膜的免疫球蛋白结合位点 894

（五）第一抗体和靶蛋白的结合 895

1．用抗靶蛋白的第一抗体与硝酸纤维素滤膜共温育的方法 895

2．用二级免疫试剂与硝酸纤维素滤膜温育的方法 895

3．酶联抗体生色底物的使用 897

第四节 mRNA的翻译 898

一、RNA在网织红细胞裂解液中的翻译 898

（一）兔网织红细胞裂解液的制备 898

（二）网织红细胞裂解液的翻译 900

二、合成mRNA的体外翻译 901

（一）合成mRNA的制备 902

（二）合成RNA的翻译 904

参考文献 905

附录A 细菌培养基、抗生素和菌株 908

一、液体培养基 908

（一）LB培养基（Luria-Bertani培养基） 908

（二）NZCYM培养基 908

（三）NZYM培养基 908

（四）NZM培养基 908

（五）高浓度肉汤 909

（六）SOB培养基 909

（七）SOC培养基 909

（八）2×YT培养基 909

（九）M9培养基 910

二、含有琼脂或琼脂糖的培养基 910

1．在液体培养基中生长的细菌培养物 911

2．在琼脂平板上生长的细菌培养物 911

（一）穿刺培养物 911

（二）含甘油的培养物 911

三、保存培养基 911

四、抗生素 912

五、用于λ噬菌体操作的溶液 912

（一）麦芽糖 912

（二）SM 912

（三）TM 913

（四）λ噬菌体稀释液 913

六、细菌菌株一览表 913

附录B 分子克隆中使用的试剂与缓冲液的配制 919

一、酸和碱的浓度 919

（一）常用缓冲液的pKa值 919

（二）各种pH值的Tris缓冲液的配制 919

（四）各种浓度的酸碱贮存液的近似pH值 920

（三）常见的市售酸碱的浓度 920

（一）酚 921

1．酚的平衡 921

（二）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 921

二、有机试剂的配制 921

三、原子量 922

1．同位素资料 924

四、贮存液 924

五、酶类 929

（一）溶菌酶 929

（二）蛋白水解酶 930

（三）无DNA酶的RNA酶 930

（四）无RNA酶的DNA酶 930

1．在琼酶糖-5′-（4-氨基苯磷酰）尿苷-2′（3′）-磷酸上进行亲和层析 930

2．Macaloid吸附法 931

六、常用缓冲液 932

3．在碘乙酸盐存在下加热处理 932

（一）磷酸缓冲液 933

（二）用于小量制备质粒DNA的碱裂解缓冲液 934

（三）电泳缓冲液 934

（四）酶缓冲液 936

附录C 核酸的性质 939

一、有关DNA的重要统计学资料 939

（一）B型DNA 939

（二）各种生物的单倍体DNA含量 939

（三）DNA的长度与其分子量的关系 941

（四）DNA在溶液中的摩尔浓度 941

二、嘌呤和嘧淀 942

（一）嘌呤环和嘧啶环的原子编号 942

（二）腺嘌呤及其有关化合物 943

（三）胞嘧啶及其有关化合物 944

（四）鸟嘌呤及其有关化合物 945

（五）胸腺嘧啶及其有关化合物 946

（六）尿嘧啶及其有关化合物 947

（七）稀有碱基 948

（八）DNA测序中用作链终止剂的核苷类似物 948

三、核苷酸序列资料库 949

附录D 密码子与氨基酸 950

一、遗传密码 950

二、在分子克隆中用于抑制无义突变的原核抑制基因 950

三、氨基酸的特性 951

（一）氨基酸的分类 951

附录E 分子克隆中的常用技术 954

一、玻璃制品和塑料制品 954

（一）玻璃制品、塑料制品及玻璃棉的硅烷化 954

二、核酸的纯化 954

（一）用酚：氯仿抽提 955

1．Saran包装膜法 956

（二）溴化乙锭荧光法测定双链DNA的含量 956

三、DNA和RNA的定量 956

（一）分光光度法测定DNA及RNA的含量 956

2．琼脂糖平板法 957

3．微型凝胶法 957

四、溴化乙锭溶液的净化处理 957

（一）溴化乙锭浓溶液（即浓度＞0.5mg/ml的溴化乙锭溶液）的净化处理 957

1．方法Ⅰ 957

2．方法Ⅱ 958

（二）溴化乙锭稀溶液（如含有0.5μg/ml溴化乙锭的电泳缓冲液）的净化处理 958

1．方法Ⅰ 958

2．方法Ⅱ 958

五、核酸的浓缩 959

（一）用乙醇或异丙醇沉淀 959

1．在微量离心管中沉淀DNA 960

2．用乙醇沉淀RNA 961

3．用氯化锂沉淀大分子RNA 962

4．用丁醇抽提法浓缩核酸 962

（二）32P标记核苷酸的乙醇—水混合液的干燥 962

六、核酸中放射性的测定 963

（一）核酸的三氯乙酸沉淀法 963

（二）DE-81滤膜吸附法 964

七、用于凝胶电泳的标准参照物 964

八、放射自显影 964

（一）荧光自显影 967

（二）不同的放射自显影方法的灵敏度 967

（三）放射自显影的操作 968

九、利用羟基磷灰石层析分离单链与双链DNA 970

十、凝胶过滤层析 972

（一）Sephadex的水化 973

（二）柱层析 973

十一、离心柱层析 974

十二、透析管的处理 975

附录F 亚克隆 976

一、3′凹端的补平 976

二、3′突出端的去除 977

三、在质粒载体上进行快速克隆 978

四、在平端DNA上加入接头 979

（一）非磷酸化接头的酶促磷酸化 980

（二）磷酸化接头与平端靶片段的连接 980

附录G 生产厂商名录表 983

附录部分参考文献 988

索引 992

译者增编附录一 注射针基本尺寸表 1022

译者增编附录二 希腊字母表 1024

译者增编附录三 专有名词详解 1025

译者增编附录四 英汉基因工程词汇 1039