动物细胞培养 基本技术和特殊应用指南 原书第6版PDF电子书下载

第1章 绪论 1

1.1历史背景 1

1.2组织培养的优点 7

1.2.1环境控制 7

1.2.2样品的特征和均一性 8

1.2.3经济、规模和机械化 8

1.2.4体内环境的体外模拟 8

1.3局限性 9

1.3.1专业技能 9

1.3.2量的问题 9

1.3.3去分化和选择 10

1.3.4细胞的起源 10

1.3.5不稳定性 10

1.4体外的主要差异 10

1.5组织培养的类型 11

第2章 培养细胞的生物学 14

2.1培养细胞的环境 14

2.2细胞黏附 14

2.2.1细胞黏附分子 15

2.2.2细胞间连接 16

2.2.3细胞外基质 16

2.2.4细胞骨架 18

2.2.5细胞迁移 18

2.3细胞增殖 18

2.3.1细胞周期 18

2.3.2细胞增殖的调控 19

2.4细胞分化 20

2.4.1细胞分化的维持 21

2.4.2细胞去分化 21

2.5细胞信号传递 24

2.6能量代谢 25

2.7培养细胞的起源 26

2.7.1培养的开始 26

2.7.2细胞系的演化 27

2.7.3细胞的衰老 28

2.7.4连续细胞系的转化与形成 28

第3章 实验室设计、布局及设备 30

3.1布局、规划和服务设施 30

3.1.1要求 32

3.1.2服务设施 34

3.1.3通风装置 35

3.2布局 35

3.2.1无菌操作区 36

3.2.2层流原理 36

3.2.3工作台 36

3.2.4检疫室和防范室 36

3.2.5培养 37

3.2.6准备区 40

3.2.7储存 41

第4章 设备及材料 44

4.1组织培养实验室的要求 44

4.2无菌区 46

4.2.1洁净台 46

4.2.2手推车 48

4.2.3无菌液操作——移液和分装 49

4.2.4倒置显微镜 53

4.2.5CCD摄像机和监视器 54

4.2.6解剖显微镜 54

4.2.7离心机 54

4.2.8细胞计数 55

4.3细胞孵育和培养 55

4.3.1恒温箱 55

4.3.2湿式CO2培养箱 56

4.3.3温度记录仪 57

4.3.4滚动架 57

4.3.5磁力搅拌器 58

4.3.6培养器皿 58

4.4实验准备和杀菌 58

4.4.1清洗 58

4.4.2培养基和试剂的制备 59

4.4.3杀菌 61

4.5储存 63

4.5.1消耗品 63

4.5.2冰箱和冷冻箱 63

4.5.3冷藏器 64

4.5.4可控速率冷冻箱 64

4.6附属设备 64

4.6.1计算机和网络 64

4.6.2普通正置显微镜 65

4.6.3低温冷冻箱 65

4.6.4共聚焦显微镜 65

4.6.5PCR循环仪 65

4.7专用设备 66

4.7.1显微注射装置 66

4.7.2集落计数器 66

4.7.3可离心淘洗机 66

4.7.4流式细胞仪 66

第5章 无菌技术 67

5.1无菌技术的目标 67

5.1.1微生物污染的风险 67

5.1.2无菌的维持 67

5.2创造无菌环境的各种因素 68

5.2.1层流 69

5.2.2安静的工作区域 71

5.2.3工作面 71

5.2.4个人卫生 73

5.2.5试剂和培养基 73

5.2.6培养物 73

5.3灭菌操作 73

5.3.1擦拭 73

5.3.2加盖 74

5.3.3灼烧 74

5.3.4试剂瓶和培养瓶的操作 74

5.3.5移液 75

5.3.6液体倾倒 75

5.4标准操作程序 76

5.5仪器和设备 82

5.5.1培养箱 82

5.5.2盒装培养物 82

5.5.3充入CO2气体 82

第6章 安全性、生物伦理及验证 83

6.1实验室安全 83

6.2危险性评估 83

6.3标准操作程序 85

6.4安全规则 85

6.5常规安全 86

6.5.1操作者 87

6.5.2设备 87

6.5.3玻璃器皿和锐利物品 87

6.5.4化学毒性 88

6.5.5气体 89

6.5.6液氮 89

6.5.7灼烧 90

6.6火 90

6.7放射性 91

6.7.1摄入 91

6.7.2放射性废弃物的处理 91

6.7.3标记的试剂 91

6.7.4高能源 91

6.8生物危害性 92

6.8.1生物防范水平 92

6.8.2微生物学安全通风橱（MSC） 94

6.8.3人体活检材料 96

6.8.4遗传操作 97

6.8.5生物危害性废弃物处理 97

6.8.6熏蒸 97

6.9生物伦理 98

6.9.1动物组织 98

6.9.2人体组织材料 98

6.10质量保证 99

6.10.1操作程序 100

6.10.2质量控制（QC） 100

6.11验证 100

6.11.1鉴定 100

6.11.2来源 101

6.11.3污染 101

第7章 培养器皿和附着物 102

7.1附着物 102

7.1.1细胞的附着和生长 102

7.1.2常见的附着材料 102

7.1.3其他替代性附着物 103

7.2表面处理 103

7.2.1基质覆盖 103

7.2.2饲养层 105

7.2.3非黏附性附着面 106

7.3培养器皿的选择 107

7.3.1细胞产量 107

7.3.2悬浮培养 109

7.3.3通风 110

7.3.4取样和分析 111

7.3.5不均匀生长 112

7.3.6价格 112

7.4特殊系统 112

7.4.1渗透性支持物 112

7.4.2三维基质 113

第8章 成分明确培养基及补充物 115

8.1培养基的发展史 115

8.2物理化学特征 115

8.2.1pH 115

8.2.2CO2和碳酸盐 116

8.2.3缓冲作用 123

8.2.4氧气 123

8.2.5渗透压 124

8.2.6温度 124

8.2.7黏滞度 125

8.2.8表面张力和成泡性 125

8.3平衡盐溶液 126

8.4完全培养基 126

8.4.1氨基酸 127

8.4.2维生素 127

8.4.3盐类 127

8.4.4葡萄糖 128

8.4.5有机补充物 128

8.4.6激素和生长因子 128

8.4.7抗生素 128

8.5血清 129

8.5.1蛋白质 130

8.5.2生长因子 131

8.5.3激素 131

8.5.4营养物及代谢物 132

8.5.5脂类 132

8.5.6矿物质 132

8.5.7抑制物 132

8.6培养基和血清的选择 132

8.6.1批次预约 134

8.6.2血清的测试 135

8.6.3热灭活 135

8.7其他添加物 136

8.7.1氨基酸水解物 136

8.7.2胚胎浸出液 136

8.7.3适应性培养基 136

第9章 无血清培养基 137

9.1血清的缺点 145

9.2无血清培养基的优点 146

9.2.1标准培养基的定义 146

9.2.2选择性培养基 146

9.2.3调节细胞增殖与分化 146

9.3无血清培养基的缺点 146

9.4血清的替代 147

9.4.1无血清培养基的商业供应 147

9.4.2血清替代物 147

9.4.3无血清传代培养 148

9.4.4激素 149

9.4.5生长因子 149

9.4.6血清中的营养物质 154

9.4.7蛋白质和多聚胺 154

9.4.8黏滞度 154

9.5无血清培养基的选择 154

9.5.1细胞或产物特异性 154

9.5.2适应无血清培养基 157

9.6无血清培养基的研发 157

9.7无血清培养基的制备 157

9.8无动物蛋白培养基 158

9.9小结 158

第10章 准备与灭菌 159

10.1准备试剂与用品 159

10.2设备与液体的灭菌 159

10.3设备 162

10.3.1玻璃器皿 162

10.3.2玻璃移液管 165

10.3.3螺口盖 168

10.3.4清洁剂的选择 170

10.3.5种类繁杂的设备 170

10.3.6可重复使用的灭菌过滤器 171

10.4试剂与培养基 173

10.4.1水 173

10.4.2纯水器的维护 175

10.4.3平衡盐溶液 175

10.4.4培养基的配制与灭菌 177

10.4.5干粉培养基 180

10.4.6特制培养基 182

10.5培养基的灭菌 183

10.5.1可高压灭菌的培养基 183

10.5.2除菌过滤 183

10.5.3血清 192

10.5.4其他试剂的准备与灭菌 195

10.6培养基的质控、检测和储存 196

10.6.1质量控制 196

10.6.2无菌检测 196

10.6.3培养物检测 197

10.6.4储存 197

第11章 原代培养 199

11.1原代培养入门 199

11.1.1用于解离组织的酶 199

11.1.2解离过程的共同特点 200

11.2组织分离 200

11.2.1小鼠胚胎 200

11.2.2鸡胚 204

11.2.3人体活检材料 206

11.3原代培养的类型 207

11.3.1原代外植 207

11.3.2酶的解离作用 210

11.3.3温胰蛋白酶消化 210

11.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化 213

11.3.5鸡胚器官原基 216

11.3.6其他酶解过程 219

11.3.7胶原酶 220

11.3.8机械法解离 222

11.3.9分离活细胞 224

11.3.10原代培养小结 225

11.3.11原始记录 225

第12章 传代培养和细胞系 227

12.1传代培养和扩增 227

12.1.1交叉污染和鉴定错误 229

12.1.2支原体污染 231

12.1.3术语定义 231

12.1.4细胞系的命名 232

12.1.5培养物的年龄 233

12.2选择细胞系 233

12.3常规培养 234

12.3.1细胞形态的意义 234

12.3.2培养基的更换 235

12.3.3标准的换液方案 236

12.4传代 238

12.4.1传代标准 240

12.4.2单层生长细胞典型的传代方案 241

12.4.3生长周期和传代比率 243

12.4.4传代时的细胞浓度 245

12.4.5悬浮培养细胞的扩增 245

12.4.6悬浮生长细胞的传代 246

12.4.7培养条件的标准化 248

12.4.8抗生素的使用 248

12.4.9培养记录 249

第13章 克隆培养及筛选 251

13.1克隆培养 251

13.2贴壁率的刺激 255

13.2.1促进克隆生长的条件 255

13.2.2条件培养基 256

13.2.3饲养层细胞 257

13.3悬浮克隆培养 259

13.4细胞克隆的分离 264

13.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术 267

13.4.2悬浮细胞克隆 268

13.5复制性培养 269

13.6选择性抑制剂 269

13.7遗传变异细胞的筛选 270

13.8细胞与基质的相互作用 272

13.8.1选择性黏附 272

13.8.2选择性脱壁 272

13.8.3基质性质 273

13.8.4选择性饲养层 273

13.8.5半固体培养基选择 273

第14章 细胞分离 275

14.1细胞密度及等密度沉降法 275

14.2细胞体积与沉降速率 279

14.2.1单位重力沉降 279

14.2.2离心淘洗分离技术 279

14.3以抗体为基础的分离技术 280

14.3.1免疫盘化法 281

14.3.2免疫磁珠分选 281

14.4荧光活化的细胞分选法 284

14.5其他分离技术 285

14.6初学者如何进行细胞分离实践 286

第15章 细胞鉴定 287

15.1鉴定的需求 287

15.2真实性验证 287

15.3保存记录和身世 288

15.4鉴定指标 288

15.4.1种属鉴定 289

15.4.2谱系或组织标记 289

15.4.3独特标记物 291

15.4.4转化 291

15.5细胞形态学 291

15.5.1显微镜使用 295

15.5.2染色 297

15.5.3细胞学检查所用培养器皿：单层培养 299

15.5.4悬浮细胞细胞学检查标本的制备 299

15.5.5光学显微照相技术 302

15.6共聚焦显微镜 303

15.7染色体分析 303

15.7.1染色体显带技术 306

15.7.2染色体分析 307

15.8DNA含量 308

15.8.1DNA杂交 308

15.8.2DNA指纹技术 308

15.8.3DNA绘谱 309

15.9RNA和蛋白质 314

15.10酶活性 314

15.10.1同工酶 314

15.10.2利用Authentikit进行同工酶电泳 315

15.11抗原标记 318

15.11.1免疫染色 320

15.11.2免疫分析 321

15.12分化 322

第16章 分化 323

16.1体内表型的表达 323

16.1.1去分化 323

16.1.2细胞谱系选择 324

16.2分化阶段 324

16.3增殖和分化 324

16.4定向和细胞谱系 325

16.5干细胞可塑性 326

16.6分化标记物 327

16.7诱导分化 328

16.7.1细胞相互作用 328

16.7.2全身性因子 330

16.7.3细胞-基质相互作用 333

16.7.4极性和细胞形状 334

16.7.5氧张力 334

16.8分化和恶性 334

16.9应用 334

第17章 转化和永生化 336

17.1在细胞系鉴定中的作用 337

17.2什么是转化 337

17.3遗传不稳定性和异质性 338

17.3.1遗传不稳定性 338

17.3.2染色体畸变 339

17.4永生化 339

17.4.1衰老的控制 340

17.4.2病毒基因致永生化 341

17.4.3人成纤维细胞的永生化 342

17.4.4端粒酶诱导的永生化 345

17.4.5淋巴细胞永生化 350

17.4.6转基因鼠 350

17.5生长控制异常 350

17.5.1停泊不依赖性 350

17.5.2接触抑制 351

17.5.3血清依赖 353

17.5.4癌基因 354

17.6致瘤性 354

17.6.1恶性化 354

17.6.2肿瘤移植 355

17.6.3侵袭力 355

17.6.4血管发生 356

17.6.5纤溶酶原活化因子 359

第18章 污染 361

18.1污染的来源 361

18.1.1操作者的技术 363

18.1.2环境 364

18.1.3层流通风橱的使用和维护 364

18.1.4湿度恒温箱 364

18.1.5冷藏库 365

18.1.6无菌材料 366

18.1.7引入的细胞系和活组织 366

18.1.8隔离 366

18.2微生物污染的种类 366

18.3污染物的监控 366

18.3.1可见的微生物污染 367

18.3.2支原体 368

18.3.3支原体的荧光染色 369

18.3.4PCR法检测支原体 370

18.3.5检测支原体的替代方法 374

18.3.6支原体检测服务 375

18.3.7病毒污染 375

18.4污染培养物的处理 375

18.5污染的去除 376

18.5.1细菌、真菌和酵母菌 376

18.5.2支原体的消除 377

18.5.3清除病毒污染 378

18.5.4顽固污染 379

18.6交叉污染 379

18.7结论 380

第19章 冻存 381

19.1冻存的意义 381

19.2冻存前注意事项 381

19.2.1鉴定 382

19.2.2何时冻存 382

19.3冻存细则 382

19.3.1细胞冻存的理论背景 382

19.3.2细胞浓度 382

19.3.3冻存液 383

19.3.4冷却速度 383

19.3.5安瓿 386

19.3.6低温冰箱 386

19.3.7培养细胞的冻存 389

19.3.8冻存记录 391

19.3.9安瓿的解冻 392

19.3.10培养瓶冻存 394

19.4玻璃化保存 394

19.4.1hES细胞的冻存 394

19.4.2hES细胞解冻 397

19.5冻存库的设计和监控 398

19.5.1冻存管理 399

19.5.2细胞库存的连续更换 399

19.6细胞库 400

19.7细胞的运输 400

19.7.1冻存安瓿 401

19.7.2活细胞 401

第20章 定量 403

20.1细胞计数 403

20.1.1血细胞计数器 404

20.1.2电子计数 407

20.1.3染色的单层细胞 411

20.1.4流式细胞仪 411

20.2细胞质量 413

20.3DNA含量 413

20.4蛋白质 414

20.4.1样品的溶解性 414

20.4.2Bradford分析 414

20.5合成速率 415

20.5.1DNA合成 415

20.5.2蛋白质合成 417

20.6准备样品用于酶分析和免疫分析 418

20.7细胞计数 419

20.7.1原位标记 419

20.7.2流式细胞术 419

20.8重复取样 419

20.8.1数据获得 419

20.8.2数据分析 420

20.9细胞增殖 420

20.9.1实验设计 421

20.9.2生长周期 421

20.9.3单层细胞生长曲线的分析 425

20.9.4培养基体积，细胞浓度和细胞密度 427

20.9.5悬浮培养 428

20.9.6生长周期的各个阶段 429

20.9.7生长曲线的衍生物 430

20.10贴壁效率 431

20.10.1集落形成分析 433

20.10.2自动集落计数 434

20.11标记指数 434

20.11.1生长分数 437

20.11.2有丝分裂指数 438

20.11.3分裂指数 438

20.12细胞周期时间 438

20.13细胞迁移 438

第21章 细胞毒性 439

21.1活性、毒性和存活 439

21.2体外局限性 440

21.2.1药物代谢动力学 440

21.2.2新陈代谢 440

21.2.3组织和全身反应 440

21.3分析的性质 440

21.3.1生存力 441

21.3.2存活 443

21.3.3细胞增殖测定 448

21.3.4代谢性细胞毒性测定 448

21.3.5微滴定实验 449

21.3.6微滴定与克隆存活的比较 453

21.3.7药物的相互作用 454

21.4细胞毒性实验的应用 454

21.4.1抗癌药物筛选 454

21.4.2肿瘤药物的前瞻性实验 454

21.4.3药物学实验 455

21.5基因毒性 455

21.5.1姐妹染色单体交换的诱变实验 455

21.5.2致癌性 458

21.6炎症反应 459

第22章 特殊类型细胞的培养 461

22.1特殊细胞培养技术 463

22.2上皮细胞 463

22.2.1表皮 464

22.2.2角膜 469

22.2.3乳腺 471

22.2.4子宫颈 473

22.2.5胃肠道 476

22.2.6肝 478

22.2.7原代肝细胞培养 478

22.2.8人肝癌细胞系HepaRG 481

22.2.9胰 483

22.2.10肾 485

22.2.11气管和支气管上皮 487

22.2.12口腔上皮 489

22.2.13前列腺 490

22.3间充质细胞 492

22.3.1结缔组织 493

22.3.2脂肪组织 493

22.3.3肌 495

22.3.4软骨 501

22.3.5骨 504

22.3.6内皮细胞 506

22.4神经外胚层细胞 512

22.4.1神经细胞 512

22.4.2神经胶质细胞 513

22.4.3内分泌细胞 519

22.4.4黑素细胞 520

22.5造血细胞 523

22.6生殖腺 524

22.6.1卵巢 524

22.6.2睾丸 524

第23章 干细胞、生殖细胞和羊水细胞 525

23.1干细胞 525

23.1.1胚胎干细胞 525

23.1.2小鼠胚胎干细胞的诱导 525

23.1.3小鼠胚胎干细胞的传代培养和扩增 530

23.1.4人胚胎干细胞的原代培养 532

23.1.5hES细胞的传代 534

23.1.6鱼胚胎来源的多能干细胞 535

23.2生殖细胞 539

23.3胚外细胞 540

23.3.1羊水细胞的培养 540

23.3.2从新生儿或青年来源的细胞 544

23.3.3成人来源的多能干细胞 544

23.3.4人骨髓来源间充质干细胞 545

23.3.5诱导多潜能干细胞 548

23.3.6小鼠骨髓长期培养 552

23.3.7人原始造血细胞长期培养 554

23.3.8造血细胞集落形成分析 559

第24章 肿瘤细胞培养 562

24.1肿瘤细胞培养中的问题 562

24.2取材 563

24.2.1代表性细胞的选择 563

24.2.2冷冻组织保存 564

24.3分离 564

24.4原代培养 565

24.5肿瘤细胞的选择培养 566

24.5.1选择培养基 566

24.5.2汇合饲养层 566

24.5.3悬浮克隆 569

24.5.4异种移植 569

24.6细胞系的建立 570

24.6.1原代肿瘤培养物的传代 570

24.6.2连续细胞系 570

24.7肿瘤细胞培养物的特征 571

24.7.1肿瘤细胞的异质性 571

24.7.2组织型培养 572

24.8特殊类型肿瘤 572

24.8.1乳腺 572

24.8.2肺 574

24.8.3胃 575

24.8.4结肠 575

24.8.5胰腺 578

24.8.6卵巢 578

24.8.7前列腺 578

24.8.8膀胱 579

24.8.9皮肤 579

24.8.10子宫颈 580

24.8.11胶质细胞瘤 580

24.8.12神经母细胞瘤 581

24.8.13精原细胞瘤 581

24.8.14淋巴瘤和白血病 581

第25章 三维培养 583

25.1细胞的相互作用和表型表达 583

25.1.1细胞密度的作用 583

25.1.2相互作用 584

25.1.3模型的选择 584

25.2器官培养 586

25.2.1气体和营养物质的交换 586

25.2.2结构的完整性 586

25.2.3生长与分化 587

25.2.4器官培养的限制 587

25.2.5器官培养的类型 587

25.3组织型培养 589

25.3.1凝胶和海绵技术 589

25.3.2中空纤维 590

25.3.3球体 590

25.3.4转动室系统 593

25.3.5藻酸盐活细胞固定术 594

25.3.6滤膜培养皿 594

25.3.7神经聚集物的培养 597

25.4器官型培养 599

25.4.1组织等同物 599

25.4.2组织工程 599

25.5三维构建物中细胞的成像 601

第26章 规模与自动化 602

26.1悬浮规模培养 602

26.1.1连续培养 605

26.1.2规模和复杂性 606

26.1.3搅匀和换气 608

26.2单层规模培养 610

26.2.1多表面扩增器 610

26.2.2旋转培养 613

26.2.3微载体 615

26.2.4巨型微载体 617

26.2.5灌流式单层培养 619

26.3程序控制 620

26.4自动化 621

26.4.1机器人细胞培养 621

26.4.2高产量检测 622

第27章 特殊技术 624

27.1淋巴细胞的制备 624

27.1.1隔离的密度 624

27.1.2淋巴母细胞的转化 625

27.2放射自显影术 626

27.3间隔性记录 632

27.4细胞同步化 634

27.4.1细胞分离 634

27.4.2阻断 635

27.5冷血动物细胞的培养 635

27.5.1鱼细胞 636

27.5.2昆虫细胞 636

27.6体细胞融合 637

27.6.1细胞杂交 637

27.6.2移核实验 640

27.7单克隆抗体的制备 640

第28章 培训纲要 646

28.1目的 646

28.2实验制备及操作技巧 647

28.3基本的细胞培养技术 660

28.4高阶练习 682

28.5特殊练习 697

第29章 问题与对策 698

29.1细胞异常形态 698

29.2细胞生长缓慢 699

29.2.1仅限于自己细胞出了问题 699

29.2.2其他人也遇到同样的问题 699

29.3培养基 700

29.3.1试剂配方、准备和存储 700

29.3.2不稳定试剂 701

29.3.3配制培养基各种成分的纯度 702

29.4基质和容器 703

29.5微生物污染 703

29.5.1仅限于单个实验者的问题 704

29.5.2普遍问题 705

29.5.3室内供气和层流净化工作台 706

29.5.4特定污染 706

29.6化学污染 707

29.6.1玻璃器皿 707

29.6.2移液管 707

29.6.3水的纯化 707

29.6.4低温冻存 707

29.6.5粉末或气溶胶 708

29.7原代培养 708

29.7.1原代培养的存活率低 708

29.7.2选择细胞错误 709

29.7.3污染 709

29.8分化 710

29.9饲养层 710

29.9.1常规单层培养 710

29.9.2克隆培养 710

29.10传代 711

29.10.1收获率低或生长缓慢 711

29.10.2生长不均匀 711

29.11克隆 712

29.11.1培养皿形成的克隆数过低 712

29.11.2培养皿形成的克隆数太多 713

29.11.3非随机分布 713

29.12交叉污染和错误标记 713

29.13冻存 714

29.13.1复苏时存活率低 714

29.13.2冻存后细胞形态发生变化 714

29.13.3冻存细胞丢失 715

29.14细胞计数 715

29.14.1血细胞计数板 715

29.14.2使用电阻抗法电子计数仪 715

第30章 结语 717

附录Ⅰ计算配制及试剂制备 719

附录Ⅱ设备及材料来源 733

附录Ⅲ供应商和其他资源 763

附录Ⅳ术语 779

附录Ⅴ交叉污染或鉴定有误的细胞系 789

附录Ⅵ一般教材与相关期刊 809

参考文献 811

索引 883