第1章 绪论 1
1.1历史背景 1
1.2组织培养的优点 7
1.2.1环境控制 7
1.2.2样品的特征和均一性 8
1.2.3经济、规模和机械化 8
1.2.4体内环境的体外模拟 8
1.3局限性 9
1.3.1专业技能 9
1.3.2量的问题 9
1.3.3去分化和选择 10
1.3.4细胞的起源 10
1.3.5不稳定性 10
1.4体外的主要差异 10
1.5组织培养的类型 11
第2章 培养细胞的生物学 14
2.1培养细胞的环境 14
2.2细胞黏附 14
2.2.1细胞黏附分子 15
2.2.2细胞间连接 16
2.2.3细胞外基质 16
2.2.4细胞骨架 18
2.2.5细胞迁移 18
2.3细胞增殖 18
2.3.1细胞周期 18
2.3.2细胞增殖的调控 19
2.4细胞分化 20
2.4.1细胞分化的维持 21
2.4.2细胞去分化 21
2.5细胞信号传递 24
2.6能量代谢 25
2.7培养细胞的起源 26
2.7.1培养的开始 26
2.7.2细胞系的演化 27
2.7.3细胞的衰老 28
2.7.4连续细胞系的转化与形成 28
第3章 实验室设计、布局及设备 30
3.1布局、规划和服务设施 30
3.1.1要求 32
3.1.2服务设施 34
3.1.3通风装置 35
3.2布局 35
3.2.1无菌操作区 36
3.2.2层流原理 36
3.2.3工作台 36
3.2.4检疫室和防范室 36
3.2.5培养 37
3.2.6准备区 40
3.2.7储存 41
第4章 设备及材料 44
4.1组织培养实验室的要求 44
4.2无菌区 46
4.2.1洁净台 46
4.2.2手推车 48
4.2.3无菌液操作——移液和分装 49
4.2.4倒置显微镜 53
4.2.5CCD摄像机和监视器 54
4.2.6解剖显微镜 54
4.2.7离心机 54
4.2.8细胞计数 55
4.3细胞孵育和培养 55
4.3.1恒温箱 55
4.3.2湿式CO2培养箱 56
4.3.3温度记录仪 57
4.3.4滚动架 57
4.3.5磁力搅拌器 58
4.3.6培养器皿 58
4.4实验准备和杀菌 58
4.4.1清洗 58
4.4.2培养基和试剂的制备 59
4.4.3杀菌 61
4.5储存 63
4.5.1消耗品 63
4.5.2冰箱和冷冻箱 63
4.5.3冷藏器 64
4.5.4可控速率冷冻箱 64
4.6附属设备 64
4.6.1计算机和网络 64
4.6.2普通正置显微镜 65
4.6.3低温冷冻箱 65
4.6.4共聚焦显微镜 65
4.6.5PCR循环仪 65
4.7专用设备 66
4.7.1显微注射装置 66
4.7.2集落计数器 66
4.7.3可离心淘洗机 66
4.7.4流式细胞仪 66
第5章 无菌技术 67
5.1无菌技术的目标 67
5.1.1微生物污染的风险 67
5.1.2无菌的维持 67
5.2创造无菌环境的各种因素 68
5.2.1层流 69
5.2.2安静的工作区域 71
5.2.3工作面 71
5.2.4个人卫生 73
5.2.5试剂和培养基 73
5.2.6培养物 73
5.3灭菌操作 73
5.3.1擦拭 73
5.3.2加盖 74
5.3.3灼烧 74
5.3.4试剂瓶和培养瓶的操作 74
5.3.5移液 75
5.3.6液体倾倒 75
5.4标准操作程序 76
5.5仪器和设备 82
5.5.1培养箱 82
5.5.2盒装培养物 82
5.5.3充入CO2气体 82
第6章 安全性、生物伦理及验证 83
6.1实验室安全 83
6.2危险性评估 83
6.3标准操作程序 85
6.4安全规则 85
6.5常规安全 86
6.5.1操作者 87
6.5.2设备 87
6.5.3玻璃器皿和锐利物品 87
6.5.4化学毒性 88
6.5.5气体 89
6.5.6液氮 89
6.5.7灼烧 90
6.6火 90
6.7放射性 91
6.7.1摄入 91
6.7.2放射性废弃物的处理 91
6.7.3标记的试剂 91
6.7.4高能源 91
6.8生物危害性 92
6.8.1生物防范水平 92
6.8.2微生物学安全通风橱（MSC） 94
6.8.3人体活检材料 96
6.8.4遗传操作 97
6.8.5生物危害性废弃物处理 97
6.8.6熏蒸 97
6.9生物伦理 98
6.9.1动物组织 98
6.9.2人体组织材料 98
6.10质量保证 99
6.10.1操作程序 100
6.10.2质量控制（QC） 100
6.11验证 100
6.11.1鉴定 100
6.11.2来源 101
6.11.3污染 101
第7章 培养器皿和附着物 102
7.1附着物 102
7.1.1细胞的附着和生长 102
7.1.2常见的附着材料 102
7.1.3其他替代性附着物 103
7.2表面处理 103
7.2.1基质覆盖 103
7.2.2饲养层 105
7.2.3非黏附性附着面 106
7.3培养器皿的选择 107
7.3.1细胞产量 107
7.3.2悬浮培养 109
7.3.3通风 110
7.3.4取样和分析 111
7.3.5不均匀生长 112
7.3.6价格 112
7.4特殊系统 112
7.4.1渗透性支持物 112
7.4.2三维基质 113
第8章 成分明确培养基及补充物 115
8.1培养基的发展史 115
8.2物理化学特征 115
8.2.1pH 115
8.2.2CO2和碳酸盐 116
8.2.3缓冲作用 123
8.2.4氧气 123
8.2.5渗透压 124
8.2.6温度 124
8.2.7黏滞度 125
8.2.8表面张力和成泡性 125
8.3平衡盐溶液 126
8.4完全培养基 126
8.4.1氨基酸 127
8.4.2维生素 127
8.4.3盐类 127
8.4.4葡萄糖 128
8.4.5有机补充物 128
8.4.6激素和生长因子 128
8.4.7抗生素 128
8.5血清 129
8.5.1蛋白质 130
8.5.2生长因子 131
8.5.3激素 131
8.5.4营养物及代谢物 132
8.5.5脂类 132
8.5.6矿物质 132
8.5.7抑制物 132
8.6培养基和血清的选择 132
8.6.1批次预约 134
8.6.2血清的测试 135
8.6.3热灭活 135
8.7其他添加物 136
8.7.1氨基酸水解物 136
8.7.2胚胎浸出液 136
8.7.3适应性培养基 136
第9章 无血清培养基 137
9.1血清的缺点 145
9.2无血清培养基的优点 146
9.2.1标准培养基的定义 146
9.2.2选择性培养基 146
9.2.3调节细胞增殖与分化 146
9.3无血清培养基的缺点 146
9.4血清的替代 147
9.4.1无血清培养基的商业供应 147
9.4.2血清替代物 147
9.4.3无血清传代培养 148
9.4.4激素 149
9.4.5生长因子 149
9.4.6血清中的营养物质 154
9.4.7蛋白质和多聚胺 154
9.4.8黏滞度 154
9.5无血清培养基的选择 154
9.5.1细胞或产物特异性 154
9.5.2适应无血清培养基 157
9.6无血清培养基的研发 157
9.7无血清培养基的制备 157
9.8无动物蛋白培养基 158
9.9小结 158
第10章 准备与灭菌 159
10.1准备试剂与用品 159
10.2设备与液体的灭菌 159
10.3设备 162
10.3.1玻璃器皿 162
10.3.2玻璃移液管 165
10.3.3螺口盖 168
10.3.4清洁剂的选择 170
10.3.5种类繁杂的设备 170
10.3.6可重复使用的灭菌过滤器 171
10.4试剂与培养基 173
10.4.1水 173
10.4.2纯水器的维护 175
10.4.3平衡盐溶液 175
10.4.4培养基的配制与灭菌 177
10.4.5干粉培养基 180
10.4.6特制培养基 182
10.5培养基的灭菌 183
10.5.1可高压灭菌的培养基 183
10.5.2除菌过滤 183
10.5.3血清 192
10.5.4其他试剂的准备与灭菌 195
10.6培养基的质控、检测和储存 196
10.6.1质量控制 196
10.6.2无菌检测 196
10.6.3培养物检测 197
10.6.4储存 197
第11章 原代培养 199
11.1原代培养入门 199
11.1.1用于解离组织的酶 199
11.1.2解离过程的共同特点 200
11.2组织分离 200
11.2.1小鼠胚胎 200
11.2.2鸡胚 204
11.2.3人体活检材料 206
11.3原代培养的类型 207
11.3.1原代外植 207
11.3.2酶的解离作用 210
11.3.3温胰蛋白酶消化 210
11.3.4低温预处理的胰蛋白酶消化 213
11.3.5鸡胚器官原基 216
11.3.6其他酶解过程 219
11.3.7胶原酶 220
11.3.8机械法解离 222
11.3.9分离活细胞 224
11.3.10原代培养小结 225
11.3.11原始记录 225
第12章 传代培养和细胞系 227
12.1传代培养和扩增 227
12.1.1交叉污染和鉴定错误 229
12.1.2支原体污染 231
12.1.3术语定义 231
12.1.4细胞系的命名 232
12.1.5培养物的年龄 233
12.2选择细胞系 233
12.3常规培养 234
12.3.1细胞形态的意义 234
12.3.2培养基的更换 235
12.3.3标准的换液方案 236
12.4传代 238
12.4.1传代标准 240
12.4.2单层生长细胞典型的传代方案 241
12.4.3生长周期和传代比率 243
12.4.4传代时的细胞浓度 245
12.4.5悬浮培养细胞的扩增 245
12.4.6悬浮生长细胞的传代 246
12.4.7培养条件的标准化 248
12.4.8抗生素的使用 248
12.4.9培养记录 249
第13章 克隆培养及筛选 251
13.1克隆培养 251
13.2贴壁率的刺激 255
13.2.1促进克隆生长的条件 255
13.2.2条件培养基 256
13.2.3饲养层细胞 257
13.3悬浮克隆培养 259
13.4细胞克隆的分离 264
13.4.1单层贴壁细胞克隆的其他分离技术 267
13.4.2悬浮细胞克隆 268
13.5复制性培养 269
13.6选择性抑制剂 269
13.7遗传变异细胞的筛选 270
13.8细胞与基质的相互作用 272
13.8.1选择性黏附 272
13.8.2选择性脱壁 272
13.8.3基质性质 273
13.8.4选择性饲养层 273
13.8.5半固体培养基选择 273
第14章 细胞分离 275
14.1细胞密度及等密度沉降法 275
14.2细胞体积与沉降速率 279
14.2.1单位重力沉降 279
14.2.2离心淘洗分离技术 279
14.3以抗体为基础的分离技术 280
14.3.1免疫盘化法 281
14.3.2免疫磁珠分选 281
14.4荧光活化的细胞分选法 284
14.5其他分离技术 285
14.6初学者如何进行细胞分离实践 286
第15章 细胞鉴定 287
15.1鉴定的需求 287
15.2真实性验证 287
15.3保存记录和身世 288
15.4鉴定指标 288
15.4.1种属鉴定 289
15.4.2谱系或组织标记 289
15.4.3独特标记物 291
15.4.4转化 291
15.5细胞形态学 291
15.5.1显微镜使用 295
15.5.2染色 297
15.5.3细胞学检查所用培养器皿：单层培养 299
15.5.4悬浮细胞细胞学检查标本的制备 299
15.5.5光学显微照相技术 302
15.6共聚焦显微镜 303
15.7染色体分析 303
15.7.1染色体显带技术 306
15.7.2染色体分析 307
15.8DNA含量 308
15.8.1DNA杂交 308
15.8.2DNA指纹技术 308
15.8.3DNA绘谱 309
15.9RNA和蛋白质 314
15.10酶活性 314
15.10.1同工酶 314
15.10.2利用Authentikit进行同工酶电泳 315
15.11抗原标记 318
15.11.1免疫染色 320
15.11.2免疫分析 321
15.12分化 322
第16章 分化 323
16.1体内表型的表达 323
16.1.1去分化 323
16.1.2细胞谱系选择 324
16.2分化阶段 324
16.3增殖和分化 324
16.4定向和细胞谱系 325
16.5干细胞可塑性 326
16.6分化标记物 327
16.7诱导分化 328
16.7.1细胞相互作用 328
16.7.2全身性因子 330
16.7.3细胞-基质相互作用 333
16.7.4极性和细胞形状 334
16.7.5氧张力 334
16.8分化和恶性 334
16.9应用 334
第17章 转化和永生化 336
17.1在细胞系鉴定中的作用 337
17.2什么是转化 337
17.3遗传不稳定性和异质性 338
17.3.1遗传不稳定性 338
17.3.2染色体畸变 339
17.4永生化 339
17.4.1衰老的控制 340
17.4.2病毒基因致永生化 341
17.4.3人成纤维细胞的永生化 342
17.4.4端粒酶诱导的永生化 345
17.4.5淋巴细胞永生化 350
17.4.6转基因鼠 350
17.5生长控制异常 350
17.5.1停泊不依赖性 350
17.5.2接触抑制 351
17.5.3血清依赖 353
17.5.4癌基因 354
17.6致瘤性 354
17.6.1恶性化 354
17.6.2肿瘤移植 355
17.6.3侵袭力 355
17.6.4血管发生 356
17.6.5纤溶酶原活化因子 359
第18章 污染 361
18.1污染的来源 361
18.1.1操作者的技术 363
18.1.2环境 364
18.1.3层流通风橱的使用和维护 364
18.1.4湿度恒温箱 364
18.1.5冷藏库 365
18.1.6无菌材料 366
18.1.7引入的细胞系和活组织 366
18.1.8隔离 366
18.2微生物污染的种类 366
18.3污染物的监控 366
18.3.1可见的微生物污染 367
18.3.2支原体 368
18.3.3支原体的荧光染色 369
18.3.4PCR法检测支原体 370
18.3.5检测支原体的替代方法 374
18.3.6支原体检测服务 375
18.3.7病毒污染 375
18.4污染培养物的处理 375
18.5污染的去除 376
18.5.1细菌、真菌和酵母菌 376
18.5.2支原体的消除 377
18.5.3清除病毒污染 378
18.5.4顽固污染 379
18.6交叉污染 379
18.7结论 380
第19章 冻存 381
19.1冻存的意义 381
19.2冻存前注意事项 381
19.2.1鉴定 382
19.2.2何时冻存 382
19.3冻存细则 382
19.3.1细胞冻存的理论背景 382
19.3.2细胞浓度 382
19.3.3冻存液 383
19.3.4冷却速度 383
19.3.5安瓿 386
19.3.6低温冰箱 386
19.3.7培养细胞的冻存 389
19.3.8冻存记录 391
19.3.9安瓿的解冻 392
19.3.10培养瓶冻存 394
19.4玻璃化保存 394
19.4.1hES细胞的冻存 394
19.4.2hES细胞解冻 397
19.5冻存库的设计和监控 398
19.5.1冻存管理 399
19.5.2细胞库存的连续更换 399
19.6细胞库 400
19.7细胞的运输 400
19.7.1冻存安瓿 401
19.7.2活细胞 401
第20章 定量 403
20.1细胞计数 403
20.1.1血细胞计数器 404
20.1.2电子计数 407
20.1.3染色的单层细胞 411
20.1.4流式细胞仪 411
20.2细胞质量 413
20.3DNA含量 413
20.4蛋白质 414
20.4.1样品的溶解性 414
20.4.2Bradford分析 414
20.5合成速率 415
20.5.1DNA合成 415
20.5.2蛋白质合成 417
20.6准备样品用于酶分析和免疫分析 418
20.7细胞计数 419
20.7.1原位标记 419
20.7.2流式细胞术 419
20.8重复取样 419
20.8.1数据获得 419
20.8.2数据分析 420
20.9细胞增殖 420
20.9.1实验设计 421
20.9.2生长周期 421
20.9.3单层细胞生长曲线的分析 425
20.9.4培养基体积，细胞浓度和细胞密度 427
20.9.5悬浮培养 428
20.9.6生长周期的各个阶段 429
20.9.7生长曲线的衍生物 430
20.10贴壁效率 431
20.10.1集落形成分析 433
20.10.2自动集落计数 434
20.11标记指数 434
20.11.1生长分数 437
20.11.2有丝分裂指数 438
20.11.3分裂指数 438
20.12细胞周期时间 438
20.13细胞迁移 438
第21章 细胞毒性 439
21.1活性、毒性和存活 439
21.2体外局限性 440
21.2.1药物代谢动力学 440
21.2.2新陈代谢 440
21.2.3组织和全身反应 440
21.3分析的性质 440
21.3.1生存力 441
21.3.2存活 443
21.3.3细胞增殖测定 448
21.3.4代谢性细胞毒性测定 448
21.3.5微滴定实验 449
21.3.6微滴定与克隆存活的比较 453
21.3.7药物的相互作用 454
21.4细胞毒性实验的应用 454
21.4.1抗癌药物筛选 454
21.4.2肿瘤药物的前瞻性实验 454
21.4.3药物学实验 455
21.5基因毒性 455
21.5.1姐妹染色单体交换的诱变实验 455
21.5.2致癌性 458
21.6炎症反应 459
第22章 特殊类型细胞的培养 461
22.1特殊细胞培养技术 463
22.2上皮细胞 463
22.2.1表皮 464
22.2.2角膜 469
22.2.3乳腺 471
22.2.4子宫颈 473
22.2.5胃肠道 476
22.2.6肝 478
22.2.7原代肝细胞培养 478
22.2.8人肝癌细胞系HepaRG 481
22.2.9胰 483
22.2.10肾 485
22.2.11气管和支气管上皮 487
22.2.12口腔上皮 489
22.2.13前列腺 490
22.3间充质细胞 492
22.3.1结缔组织 493
22.3.2脂肪组织 493
22.3.3肌 495
22.3.4软骨 501
22.3.5骨 504
22.3.6内皮细胞 506
22.4神经外胚层细胞 512
22.4.1神经细胞 512
22.4.2神经胶质细胞 513
22.4.3内分泌细胞 519
22.4.4黑素细胞 520
22.5造血细胞 523
22.6生殖腺 524
22.6.1卵巢 524
22.6.2睾丸 524
第23章 干细胞、生殖细胞和羊水细胞 525
23.1干细胞 525
23.1.1胚胎干细胞 525
23.1.2小鼠胚胎干细胞的诱导 525
23.1.3小鼠胚胎干细胞的传代培养和扩增 530
23.1.4人胚胎干细胞的原代培养 532
23.1.5hES细胞的传代 534
23.1.6鱼胚胎来源的多能干细胞 535
23.2生殖细胞 539
23.3胚外细胞 540
23.3.1羊水细胞的培养 540
23.3.2从新生儿或青年来源的细胞 544
23.3.3成人来源的多能干细胞 544
23.3.4人骨髓来源间充质干细胞 545
23.3.5诱导多潜能干细胞 548
23.3.6小鼠骨髓长期培养 552
23.3.7人原始造血细胞长期培养 554
23.3.8造血细胞集落形成分析 559
第24章 肿瘤细胞培养 562
24.1肿瘤细胞培养中的问题 562
24.2取材 563
24.2.1代表性细胞的选择 563
24.2.2冷冻组织保存 564
24.3分离 564
24.4原代培养 565
24.5肿瘤细胞的选择培养 566
24.5.1选择培养基 566
24.5.2汇合饲养层 566
24.5.3悬浮克隆 569
24.5.4异种移植 569
24.6细胞系的建立 570
24.6.1原代肿瘤培养物的传代 570
24.6.2连续细胞系 570
24.7肿瘤细胞培养物的特征 571
24.7.1肿瘤细胞的异质性 571
24.7.2组织型培养 572
24.8特殊类型肿瘤 572
24.8.1乳腺 572
24.8.2肺 574
24.8.3胃 575
24.8.4结肠 575
24.8.5胰腺 578
24.8.6卵巢 578
24.8.7前列腺 578
24.8.8膀胱 579
24.8.9皮肤 579
24.8.10子宫颈 580
24.8.11胶质细胞瘤 580
24.8.12神经母细胞瘤 581
24.8.13精原细胞瘤 581
24.8.14淋巴瘤和白血病 581
第25章 三维培养 583
25.1细胞的相互作用和表型表达 583
25.1.1细胞密度的作用 583
25.1.2相互作用 584
25.1.3模型的选择 584
25.2器官培养 586
25.2.1气体和营养物质的交换 586
25.2.2结构的完整性 586
25.2.3生长与分化 587
25.2.4器官培养的限制 587
25.2.5器官培养的类型 587
25.3组织型培养 589
25.3.1凝胶和海绵技术 589
25.3.2中空纤维 590
25.3.3球体 590
25.3.4转动室系统 593
25.3.5藻酸盐活细胞固定术 594
25.3.6滤膜培养皿 594
25.3.7神经聚集物的培养 597
25.4器官型培养 599
25.4.1组织等同物 599
25.4.2组织工程 599
25.5三维构建物中细胞的成像 601
第26章 规模与自动化 602
26.1悬浮规模培养 602
26.1.1连续培养 605
26.1.2规模和复杂性 606
26.1.3搅匀和换气 608
26.2单层规模培养 610
26.2.1多表面扩增器 610
26.2.2旋转培养 613
26.2.3微载体 615
26.2.4巨型微载体 617
26.2.5灌流式单层培养 619
26.3程序控制 620
26.4自动化 621
26.4.1机器人细胞培养 621
26.4.2高产量检测 622
第27章 特殊技术 624
27.1淋巴细胞的制备 624
27.1.1隔离的密度 624
27.1.2淋巴母细胞的转化 625
27.2放射自显影术 626
27.3间隔性记录 632
27.4细胞同步化 634
27.4.1细胞分离 634
27.4.2阻断 635
27.5冷血动物细胞的培养 635
27.5.1鱼细胞 636
27.5.2昆虫细胞 636
27.6体细胞融合 637
27.6.1细胞杂交 637
27.6.2移核实验 640
27.7单克隆抗体的制备 640
第28章 培训纲要 646
28.1目的 646
28.2实验制备及操作技巧 647
28.3基本的细胞培养技术 660
28.4高阶练习 682
28.5特殊练习 697
第29章 问题与对策 698
29.1细胞异常形态 698
29.2细胞生长缓慢 699
29.2.1仅限于自己细胞出了问题 699
29.2.2其他人也遇到同样的问题 699
29.3培养基 700
29.3.1试剂配方、准备和存储 700
29.3.2不稳定试剂 701
29.3.3配制培养基各种成分的纯度 702
29.4基质和容器 703
29.5微生物污染 703
29.5.1仅限于单个实验者的问题 704
29.5.2普遍问题 705
29.5.3室内供气和层流净化工作台 706
29.5.4特定污染 706
29.6化学污染 707
29.6.1玻璃器皿 707
29.6.2移液管 707
29.6.3水的纯化 707
29.6.4低温冻存 707
29.6.5粉末或气溶胶 708
29.7原代培养 708
29.7.1原代培养的存活率低 708
29.7.2选择细胞错误 709
29.7.3污染 709
29.8分化 710
29.9饲养层 710
29.9.1常规单层培养 710
29.9.2克隆培养 710
29.10传代 711
29.10.1收获率低或生长缓慢 711
29.10.2生长不均匀 711
29.11克隆 712
29.11.1培养皿形成的克隆数过低 712
29.11.2培养皿形成的克隆数太多 713
29.11.3非随机分布 713
29.12交叉污染和错误标记 713
29.13冻存 714
29.13.1复苏时存活率低 714
29.13.2冻存后细胞形态发生变化 714
29.13.3冻存细胞丢失 715
29.14细胞计数 715
29.14.1血细胞计数板 715
29.14.2使用电阻抗法电子计数仪 715
第30章 结语 717
附录Ⅰ计算配制及试剂制备 719
附录Ⅱ设备及材料来源 733
附录Ⅲ供应商和其他资源 763
附录Ⅳ术语 779
附录Ⅴ交叉污染或鉴定有误的细胞系 789
附录Ⅵ一般教材与相关期刊 809
参考文献 811
索引 883