分子克隆实验指南 下 原书第4版PDF电子书下载

上册 1

第1章DNA的分离及定量 1

导言 2

方案1 SDS碱裂解法制备质粒DNA：少量制备 9

方案2 SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备 12

方案3从革兰氏阴性菌（如E.coli）中分离DNA 15

方案4乙醇法沉淀DNA 17

方案5异丙醇法沉淀DNA 21

方案6用微量浓缩机进行核酸的浓缩和脱盐 22

方案7丁醇抽提法浓缩核酸 23

方案8聚乙二醇沉淀法制备M13噬菌体单链DNA 24

方案9 M13噬菌体铺平板 27

方案10 M13噬菌体液体培养 30

方案11 M13噬菌体双链（复制型）DNA的制备 32

方案12利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA 35

方案13用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA 37

方案14一步法同时提取细胞或组织中的DNA、RNA和蛋白质 43

方案15 从鼠尾或其他小样本中制备基因组DNA 46

替代方案：不使用有机溶剂从鼠尾分离DNA 48

替代方案：一管法从鼠尾中分离DNA 49

方案16快速分离酵母DNA 50

方案17微型凝胶电泳后使用溴化乙锭（EB）估算条带中DNA数量 52

方案18利用Hoechst 33258通过荧光分析仪估算DNA浓度 53

方案19用PicoGreen定量溶液中的DNA 55

信息栏 56

第2章DNA分析 62

导言 63

方案1琼脂糖凝胶电泳 73

方案2琼脂糖凝胶中DNA的染色检测 76

方案3聚丙烯酰胺凝胶电泳 80

方案4聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测 85

方案5聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测 86

方案6碱性琼脂糖凝胶电泳 87

附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影 90

方案7成像：放射自显影和感光成像 91

方案8用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA 96

方案9低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提法 98

方案10聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法 101

方案11 Southern印迹 103

方案12 Southern印迹：DNA从一块琼脂糖凝胶同时向两张膜转移 110

方案13采用放射性标记探针对固定在膜上的核酸DNA进行Southern杂交 112

附加方案：从膜上洗脱探针 117

信息栏 119

第3章 质粒载体克隆与转化 122

导言 123

方案1制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法：高效转化策略 126

方案2制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：“超级感受态”细胞 131

方案3大肠杆菌的简单转化：纳米颗粒介导的转化 135

替代方案：一步法制备感受态大肠杆菌：在同一溶液中转化和储存细菌细胞 136

方案4电穿孔法转化大肠杆菌 138

方案5质粒载体克隆：定向克隆 143

方案6质粒载体克隆：平末端克隆 145

方案7质粒DNA的去磷酸化 148

方案8向平末端DNA添加磷酸化衔接子／接头 150

方案9克隆PCR产物：向扩增DNA的末端添加限制性酶切位点 151

方案10克隆PCR产物：平末端克隆 154

方案11克隆PCR产物：制备T载体 157

方案12克隆PCR产物：TA克隆 159

方案13克隆PCR产物：TOPO TA克隆 161

方案14使用X-Gal和IPTG筛选细菌菌落：α-互补 165

信息栏 167

第4章Gateway重组克隆 205

导言 206

方案1扩增Gateway载体 210

方案2制备可读框入门克隆和目的克隆 213

方案3应用多位点LR克隆反应制备目的克隆 219

信息栏 222

第5章 细菌人工染色体及其他高容量载体的应用 223

导言 224

方案1 BAC DNA的小量分离和PCR检验 235

方案2 BAC DNA的大量制备和线性化 238

方案3通过脉冲电场凝胶电泳检验BAC DNA的质量和数量 241

方案4两步BAC工程：穿梭载体DNA的制备 242

方案5 A同源臂（A-Box）和B同源臂（B-Box）的制备 244

方案6克隆A和B同源臂到穿梭载体 247

方案7重组穿梭载体的制备和检验 249

方案8通过电穿孔法转化重组穿梭载体到感受态BAC宿主细胞 251

方案9共合体的检验和重组BAC克隆的筛选 253

方案10一步BAC修饰：质粒制备 256

方案11 A同源臂（A-Box）的制备 259

方案12克隆A同源臂到报道穿梭载体 260

方案13用RecA载体转化BAC宿主 263

方案14转移报道载体到BAC／RecA细胞以及共合体的筛选 265

方案15 酿酒酵母（S.cerevisiae）的生长和DNA制备 267

方案16酵母DNA的小量制备 269

信息栏 270

第6章 真核细胞RNA的提取、纯化和分析 275

导言 276

方案1从哺乳动物的细胞和组织中提取总RNA 279

替代方案 从小量样本提取RNA 281

方案2从斑马鱼胚胎和成体中提取总RNA 282

方案3从黑腹果蝇提取总RNA 283

方案4从秀丽隐杆线虫中提取总RNA 285

方案5从酿酒酵母菌中采用热酸酚提取总RNA 287

方案6 RNA定量和储存 289

方案7 RNA的乙醇沉淀 295

方案8通过无RNase的DNase Ⅰ处理去除RNA样品中的DNA污染 297

方案9 Oligo （dT）磁珠法提取poly （A）＋mRNA 298

方案10按照大小分离RNA：含甲醛的琼脂糖凝胶电泳 308

方案11根据分子质量大小分离RNA： RNA的尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 312

方案12琼脂糖凝胶中变性RNA的转膜和固定 319

替代方案 下行毛细管转移 323

方案13聚丙烯酰胺凝胶的电转移和膜固定 325

方案14 Northern杂交 327

方案15 纯化RNA的点杂交和狭缝杂交 330

方案16用核酸酶S1对RNA作图 342

方案17核糖核酸酶保护分析：用核糖核酸酶和放射性标记的RNA探针对RNA作图 349

方案18引物延伸法分析RNA 355

信息栏 359

第7章 聚合酶链反应 363

导言 364

方案1基础PCR 375

方案2热启动PCR 380

方案3降落PCR 383

方案4高GC含量模板的PCR扩增 385

方案5长片段高保真PCR （LA PCR） 390

方案6反向PCR 393

方案7巢式PCR 397

方案8 mRNA反转录产物cDNA的扩增：两步法RT-PCR 400

方案9由mRNA的5′端进行序列的快速扩增：5′-RACE 409

方案10由mRNA的3′端进行序列的快速扩增：3′-RACE 416

方案11使用PCR筛选克隆 422

信息栏 424

第8章 生物信息学 431

导言 432

方案1使用UCSC基因组浏览器将基因组注释可视化 434

方案2使用BLAST和ClustalW进行序列比对和同源性检索 444

方案3使用Primer3 Plus设计PCR引物 450

方案4使用微阵列和RNA-seq进行表达序列谱分析 461

方案5将上亿短读段定位至参考基因组上 472

方案6识别ChIP-seq数据集中富集的区域（寻峰） 483

方案7发现顺式调控基序 495

信息栏 503

中册 509

第9章 实时荧光聚合酶链反应定量检测DNA及RNA 509

导言 510

方案1实时PCR反应用引物和探针浓度的优化 532

方案2制作标准曲线 537

方案3实时荧光PCR定量检测DNA 540

方案4实时荧光PCR定量检测RNA 542

方案5实时荧光PCR实验数据的分析和归一化 545

信息栏 550

第10章 核酸平台技术 551

导言 552

方案1印制微阵列 560

方案2 Round A／Round B DNA扩增 564

方案3核小体DNA和其他小于500bp的DNA的T7线性扩增（TLAD） 567

方案4 RNA的扩增 572

方案5 RNA的Cyanine-dUTP直接标记 578

方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP间接标记 581

方案7用Klenow酶对DNA进行Cyanine-dCTP标记 583

方案8 DNA的间接标记 585

方案9封闭自制微阵列上的多聚赖氨酸 587

方案10自制微阵列的杂交 589

第11章DNA测序 595

导言 596

方案1毛细管测序质粒亚克隆的制备 620

方案2毛细管测序之PCR产物的制备 625

方案3循环测序反应 627

方案4全基因组：手工文库制备 630

方案5全基因组：自动化的无索引文库制备 636

附加方案 自动化的文库制备 642

方案6全基因组：自动化的带索引文库制备 644

方案7用于Illumina测序的3kb末端配对文库的制备 651

方案8用于Illumina测序的8kb末端配对文库的制备 659

附加方案AMPure磁珠校准 671

方案9 RNA-Seq：RNA反转录为cDNA及其扩增 673

附加方案RNAClean XP磁珠纯化（RNA-Seq前） 679

方案10液相外显子组捕获 680

附加方案AMPure XP磁珠纯化 688

附加方案 琼脂糖凝胶大小筛选 689

方案11自动化大小筛选 690

方案12用SYBR Green-qPCR进行文库定量 693

方案13用PicoGreen荧光法进行文库DNA定量 696

方案14文库定量：用Qubit系统对双链或单链DNA进行荧光定量 700

方案15为454测序制备小片段文库 702

方案16单链DNA文库的捕获及emPCR 708

方案17 Roche／454测序：执行一个测序运行 714

方案18结果有效性确认 721

方案19测序数据的质量评估 723

方案20数据分析 724

信息栏 725

第12章 哺乳动物细胞中DNA甲基化分析 729

导言 730

方案1 DNA亚硫酸氢盐测序法检测单个核苷酸的甲基化 735

方案2甲基化特异性聚合酶链反应法检测特定基因的DNA甲基化 742

方案3基于甲基化胞嘧啶免疫沉淀技术的DNA甲基化分析 745

方案4高通量深度测序法绘制哺乳动物细胞DNA甲基化图谱 749

方案5亚硫酸氢盐转化的DNA文库的Roche 454克隆测序 760

方案6亚硫酸氢盐转化的DNA文库的Illumina测序 765

信息栏 770

第13章 标记的DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针的制备 775

导言 776

方案1随机引物法：用随机寡核苷酸延伸法标记纯化的DNA片段 792

方案2随机引物法：在融化琼脂糖存在下用随机寡核苷酸延伸法标记DNA 798

方案3用切口平移法标记DNA探针 800

方案4用聚合酶链反应标记DNA探针 804

附加方案 不对称探针 808

方案5体外转录合成单链RNA探针 809

附加方案用PCR法将噬菌体编码的RNA聚合酶启动子加至DNA片段上 816

方案6用随机寡核苷酸引物法从mRNA合成cDNA探针 818

方案7用随机寡核苷酸延伸法制备放射性标记的消减cDNA探针 820

方案8用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3′端 825

方案9用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化 831

方案10含5′突出羟基端的DNA分子磷酸化 833

方案11去磷酸化的平端或5′凹端DNA分子的磷酸化 836

方案12用T4多核苷酸激酶进行寡核苷酸5′端的磷酸化 839

方案13用末端脱氧核苷酸转移酶标记寡核苷酸3′端 841

替代方案用TdT合成非放射性标记的探针 843

附加方案 加尾反应 843

附加方案 合成非放射性标记探针的修饰 844

方案14用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记合成的寡核苷酸 845

方案15 用乙醇沉淀法纯化标记的寡核苷酸 849

方案16用空间排阻层析法纯化标记的寡核苷酸 850

方案17用Sep-Pak C18柱色谱法纯化标记的寡核苷酸 852

方案18寡核苷酸探针在水溶液中杂交：在含季铵盐缓冲液中洗涤 854

信息栏 857

第14章 体外诱变方法 871

导言 872

方案1用易错DNA聚合酶进行随机诱变 879

方案2重叠延伸PCR产生插入或缺失诱变 890

方案3以双链DNA为模板的体外诱变：用Dpn Ⅰ选择突变体 897

方案4突变型β-内酰胺酶选择法定点诱变 904

方案5通过单一限制性位点消除进行寡核苷酸指导的诱变（USE诱变） 910

方案6利用密码子盒插入进行饱和诱变 915

方案7随机扫描诱变 922

方案8多位点定向诱变 926

方案9基于PCR的大引物诱变 930

信息栏 933

第15章 向培养的哺乳动物细胞中导入基因 937

导言 938

方案1阳离子脂质试剂介导的DNA转染 942

替代方案 采用DOTMA和DOGS进行转染 948

附加方案 单层细胞组织化学染色检测β-半乳糖苷酶 950

方案2磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 952

替代方案 磷酸钙介导的质粒DNA高效转染真核细胞 956

方案3磷酸钙介导的高分子质量基因组DNA转染细胞 959

替代方案 磷酸钙介导的贴壁细胞的转染 962

替代方案 磷酸钙介导的悬浮生长细胞的转染 963

方案4 DEAE-葡聚糖介导的转染：高效率的转染方法 964

替代方案DEAE-葡聚糖介导的转染：提高细胞活力的方案 966

方案5电穿孔转染DNA 968

方案6通过alamarBlue法分析细胞活力 972

方案7通过乳酸脱氢酶法分析细胞活力 974

方案8通过MTT法分析细胞活力 977

信息栏 980

第16章 向哺乳动物细胞中导入基因：病毒载体 998

导言 999

方案1直接克隆法构建重组腺病毒基因组 1019

方案2将克隆的重组腺病毒基因组释放用于挽救和扩增 1023

方案3氯化铯梯度沉降法纯化重组腺病毒 1028

方案4限制性内切核酸酶消化法鉴定纯化后的重组腺病毒基因组 1031

方案5 TCID50终点稀释结合qPCR测定重组腺病毒感染滴度 1034

附加方案 准备qPCR的DNA标准品 1042

方案6浓缩传代和Real-Time qPCR法检测有复制能力腺病毒（RCA） 1043

方案7瞬时转染法制备rAAV 1051

方案8氯化铯梯度沉降法纯化rAAV 1054

方案9碘克沙醇梯度离心法纯化rAAV 1059

方案10肝素亲和层析法纯化rAAV2 1062

方案11阴离子交换柱层析法从碘克沙醇梯度离心后的rAAV样本中富集完全包装病毒 1065

方案12实时定量PCR法测定rAAV基因组拷贝数 1068

方案13 TCID50终点稀释结合qPCR法灵敏测定rAAV感染滴度 1071

方案14负染色法和高分辨电子显微镜分析rAAV样本形态 1074

方案15 银染SDS-PAGE分析rAAV纯度 1076

方案16高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备 1079

方案17慢病毒载体的滴定 1085

方案18监测慢病毒载体储备液中的可复制型病毒 1089

信息栏 1091

下册 1102

第17章 利用报道基因系统分析基因表达调控 1102

导言 1103

方案1哺乳动物细胞提取物中β-半乳糖苷酶的测定 1112

附加方案 化学发光实验检测β-半乳糖苷酶活性 1115

方案2单萤光素酶报道基因实验 1118

方案3双萤光素酶报道基因实验 1123

方案4酶联免疫吸附试验定量检测绿色荧光蛋白 1128

方案5用四环素调控基因表达建立细胞系 1131

附加方案 有限稀释法筛选悬浮细胞的稳定克隆 1138

信息栏 1140

第18章RNA干扰与小RNA分析 1170

导言 1171

方案1双链siRNA制备 1185

方案2通过转染双链siRNA在哺乳动物细胞中进行RNA干扰 1187

方案3通过转染双链siRNA在果蝇S2细胞中进行RNA干扰 1190

方案4体外转录法制备dsRNA 1192

方案5采用dsRNA浸泡果蝇S2细胞进行RNA干扰 1196

方案6采用dsRNA转染在果蝇S2细胞中进行RNA干扰 1198

方案7小RNA的Northern杂交分析 1199

方案8反转录定量PCR分析小RNA 1203

方案9构建小RNA高通量测序文库 1206

方案10抑制miRNA功能的反义寡核苷酸制备 1215

方案11在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA功能 1216

方案12在果蝇S2细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA功能 1218

信息栏 1219

第19章 克隆基因的表达以及目的蛋白的纯化和分析 1225

导言 1226

方案1在大肠杆菌中利用可用IPTG诱导的启动子表达克隆化基因 1249

附加方案 目标蛋白可溶性表达的小量试验 1255

替代方案 在大肠杆菌中利用阿拉伯糖BAD启动子表达克隆基因 1260

替代方案 信号肽融合蛋白的亚细胞定位 1261

方案2用杆状病毒表达系统表达克隆基因 1265

附加方案 噬菌斑测定法确定杆状病毒原液的滴度 1271

替代方案 用于转染昆虫细胞的杆粒DNA制备 1274

方案3用甲醇诱导启动子AOX1在毕赤酵母中表达克隆基因 1277

附加方案 酵母培养物的冻存 1287

方案4用于纯化大肠杆菌中表达可溶性蛋白的细胞提取物的制备 1291

附加方案 酵母细胞玻璃珠裂解法 1296

替代方案 温和的热诱导的酶裂解法制备大肠杆菌细胞提取物 1298

替代方案 用溶菌酶裂解和冻融法联用制备大肠杆菌细胞提取物 1300

方案5采用固化的金属亲和层析纯化多聚组氨酸标记的蛋白质 1302

附加方案Ni2＋-NTA树脂的清洗与再生 1309

替代方案 组氨酸标签蛋白的快速液相色谱纯化 1310

方案6采用谷胱甘肽树脂以亲和层析纯化融合蛋白 1314

方案7包含体中表达蛋白的增溶 1321

方案8蛋白质的SDS-PAGE 1325

替代方案 用考马斯亮蓝进行SDS-PAGE凝胶染色的各种不同方法 1335

替代方案 用银盐进行SDS-PAGE凝胶染色 1336

方案9蛋白质的免疫印迹分析 1340

方案10测定蛋白质浓度的方法 1347

信息栏 1353

第20章 利用交联技术分析染色质结构与功能 1358

导言 1359

方案1甲醛交联 1369

方案2制备用于染色质免疫沉淀的交联染色质 1371

方案3染色质免疫沉淀（ChIP） 1373

方案4染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR） 1377

方案5染色质免疫沉淀-芯片杂交（ChIP-chip） 1378

方案6染色质免疫沉淀-高通量测序（ChIP-seq） 1385

方案7交联细胞3C文库的制备 1389

方案8环形染色质免疫沉淀（ChIP-loop）文库的制备 1393

方案9连接产物对照组文库的制备 1398

方案10 PCR检测3C、 ChIP-loop和对照文库中的3C连接产物：文库滴定与相互作用频率分析 1400

方案11 3C、 ChIP-loop和对照组文库的4C分析 1404

方案12 3C、 ChIP-loop和对照组文库的5C分析 1408

信息栏 1412

第21章 紫外交联免疫沉淀（CLIP）技术进行体内RNA结合位点作图 1415

导言 1416

方案1 CLIP实验免疫沉淀严谨性的优化 1424

方案2活细胞的紫外交联和裂解物制备 1429

方案3 RNA酶滴定、免疫沉淀及SDS-PAGE 1432

方案4 3′-接头的连接和用SDS-PAGE进行大小选择 1441

替代方案 去磷酸化RL3接头5端的标记 1445

方案5 RNA标签的分离、5′-接头的连接和反转录PCR扩增 1446

方案6 RNA CLIP标签测序 1456

方案7 RNA接头胶回收及保存 1458

信息栏 1460

第22章Gateway相容酵母单杂交和双杂交系统 1464

导言 1465

方案1构建酵母单杂交DNA-诱饵菌株 1474

替代方案 用复性引物从DNA诱饵中获得入门克隆产物 1481

方案2生成酵母双杂交DB-诱饵菌株 1484

方案3从活化域捕获文库中鉴定相互作用分子 1490

方案4高效的酵母转化 1496

方案5用于β-半乳糖苷酶活力的菌落转移比色测定 1500

方案6酵母克隆的PCR 1502

信息栏 1504

附录1试剂和缓冲液 1507

附录2常用技术 1533

附录3检测系统 1541

附录4一般安全原则和危险材料 1565

索引 1573