RNA干扰的生物学原理与应用PDF电子书下载

1 RNA干扰理论的研究历程 1

1.1 RNA干扰理论的萌芽阶段 2

1.2 RNA干扰理论的诞生 5

1.3 RNA干扰理论的白热化阶段 7

1.4 RNA干扰技术加盟基因组学 11

1.5 RNA干扰的研究前沿 12

2 RNA干扰理论的开发应用前景 14

2.1 RNA干扰：科学时髦还是技术革命 14

2.2 RNA干扰是生物体细胞调节基因表达的内在机制 15

2.3 RNA干扰工作机制的特点 16

2.3.1 RNA干扰技术应用的普遍性 17

2.3.2 RNA干扰的高效性 17

2.4 RNA干扰是基因功能分析的工具 18

2.3.3 RNA干扰的特异性 18

2.4.1　体外细胞培养 19

2.4.2 RNA干扰芯片分析系统 20

2.4.3　“基因敲低小鼠” 21

2.5 RNA干扰应用于疾病治疗的前景 22

2.5.1　用于疾病治疗的RNA干扰工具 23

2.5.2　体内注入RNA干扰的方案 26

2.5.3　RNA干扰疗法的适应证 27

3 RNA对基因表达的调控 33

3.1 转录水平的基因沉默 33

3.1.1 RNA介导的DNA甲基化 34

3.1.2 RNA介导的异染色质形成 41

3.1.3 RNA介导的DNA分子消融 43

3.2　转录后水平的基因沉默：siRNA介导的RNA干扰 44

3.2.1　生物体自然的RNA干扰现象 45

3.2.2 siRNA介导的RNA干扰的机制 47

3.2.3 RNA干扰的生物学意义 52

3.3　转录后水平的基因沉默：miRNA介导的RNA干扰 54

3.3.1 miRNA分子的发现 54

3.3.2 miRNA分子的筛查方法 55

3.3.3 miRNA的生物来源 55

3.3.4 miRNA的功能分类 56

3.3.5 miRNA与siRNA介导的RNA干扰机制的联系与区别 57

4 RNA干扰的生物化学 59

4.1 研究RNA干扰生物化学的模型 59

4.1.1 RNA干扰体内研究的初探 59

4.1.2 RNA干扰的生物化学模型 60

4.1.3 哺乳动物细胞中RNA干扰的生化机制 61

4.2 RNase Ⅲ的研究 62

4.2.1　细菌的RNase Ⅲ 63

4.2.2　酵母RNase Ⅲ同源分子的底物和功能 67

4.2.3　高等真核生物RNase Ⅲ同源分子结构与功能 69

4.3 Dicer的研究 70

4.3.1 Dicer的生物学特性 70

4.3.2 Dicer的生物学功能 71

4.4 RISC复合酶的研究 73

4.5 RNA依赖性RNA聚合酶的研究 78

4.5.1　番茄细胞RdRP的发现 79

4.5.2 RdRP的纯化和物理特性 80

4.5.3 RdRP的体外催化特性 80

4.5.4 RdRP在基因沉默中的作用 81

4.5.5 RdRP同源基因在几种生物基因沉默中的研究 82

4.5.6　基因沉默中RdRP作用模型 84

4.6 RNA和DNA解旋酶 85

5　小分子干扰RNA 87

5.1　小分子干扰RNA 87

5.1.1 siRNA的起源与定义 87

5.1.2 RISC的形成以及mRNA的切割 87

5.1.3 siRNA介导的RISC复合体对mRNA的剪切作用 88

5.2　微小分子干扰RNA 89

5.2.1 miRNA的发现与定义 89

5.2.2 miRNA的生物起源 90

5.2.3 miRNA对基因表达的抑制性调控 92

5.2.4　miRNA的研究手段 96

5.3.1 siRNA与miRNA具有不同的起源 98

5.3.2 siRNA与miRNA对基因调控有不同的调控方式 98

5.3　两种引起RNA干扰的功能小分子的异同及其作用 98

5.3.3　未来要解决的问题 99

6　线虫的RNA干扰机制和应用 100

6.1　线虫模型的简介 101

6.1.1　理想的模式生物——秀丽新杆线虫 101

6.1.2　优秀的研究模型 103

6.1.3　用于基因功能分析的秀丽新杆线虫 104

6.2　线虫的RNA干扰机制 105

6.2.1　线虫RNA干扰特点及分子机制 105

6.2.2　放大倍增作用 108

6.2.3　RNA干扰技术要点 109

6.3　线虫RNA干扰的实验技术 110

6.3.1　体外dsRNA的构建 110

6.3.2 dsRNA的表达产生途径 111

6.3.3 siRNA的合成方法 112

6.3.4 dsRNA的导入方法 113

6.3.5　表达双链dsRNA的转基因线虫 116

6.4 RNA干扰在线虫中的应用 116

6.4.1 RNA干扰技术的优点 116

6.4.2　线虫功能基因组学的理想工具 117

6.4.3　用于研究线虫信号传导 119

6.4.4　寄生虫的RNA干扰 119

6.4.5　发育生物学与神经科学 120

6.4.6　生物进化分析 120

6.5 stRNA与miRNA 121

7　果蝇的RNA干扰机制及其应用 123

7.1　果蝇模型的简介 124

7.1.1　优秀的模式生物——果蝇 124

7.1.2　果蝇细胞株的选择与培养 125

7.2　果蝇中的RNA干扰机制 126

7.2.1 Dicer的发现以及其作用方式 127

7.2.2 RNA干扰的标准模型 128

7.2.3 RNA诱导的沉默复合体——RISC 130

7.2.4 RNA干扰是一个依赖ATP的过程 131

7.3　果蝇RNA干扰的实验技术 131

7.3.1 双链RNA的制备 131

7.3.2 细胞转染 134

7.3.3　转染结果分析 136

7.4 RNA干扰在果蝇中的应用 137

7.4.1　功能基因组学研究 137

7.4.2　热诱导控制 139

7.4.3　在治疗疾病和药物开发中的应用 139

7.4.4　研究信号传导通路 141

8　高等生物的RNA干扰 142

8.1　高等植物的RNA干扰机制 142

8.1.1　植物功能基因研究中的问题 142

8.1.2　植物中不同的RNA沉默途径 143

8.1.3　植物中RNA干扰的机制 144

8.1.4　植物RNA干扰的蛋白质家族 144

8.1.5　植物RNA干扰的常用载体种类及其优缺点 145

8.1.6　植物RNA沉默的启动和放大 146

8.1.7　植物中miRNA的反馈调节 147

8.1.8　植物中miRNA的功能研究 148

8.2　哺乳动物的RNA干扰机制 152

8.2.1 哺乳动物中的RNA干扰机制 152

8.2.2　哺乳动物中的两种RNA干扰类型 154

8.2.3　动物模型的研究 155

8.2.4 miRNA的研究 157

8.2.5　哺乳动物细胞内小分子RNA在DNA甲基化和异染色质化中的作用 159

8.2.6 RNA干扰机制与生物医学应用的联系 160

8.2.7 RNA干扰在临床治疗中的问题和挑战 165

9 siRNA的设计方法 166

9.1　随机siRNA设计法 169

9.2　常规siRNA设计法 170

9.3　应用反义寡核苷酸芯片筛选siRNA 173

9.3.1　筛选mRNA中易接近的区域 174

9.3.2 针对IGFIR设计siRNA 175

9.4　运用多元生物信息法则设计siRNA 176

9.4.1　理性siRNA设计的生物学原理 177

9.4.2　理性规则设计的siRNA的效能和寿命 178

9.4.3　理性规则设计的siRNA的特异性 179

10　外源性siRNA的合成和体外导入方法 181

10.1 siRNA的化学合成 182

10.1.1 siRNA的化学合成方法 182

10.1.2 siRNA的2′-ACE去保护和退火 182

10.1.3 siRNA去盐和乙醇沉淀 183

10.1.4 siRNA定量检测 184

10.2 T7启动的体外转录和酶切siRNA合成 184

10.2.1 体外转录法合成siRNA的原理 185

10.2.2　设计DNA寡核苷酸模板合成siRNA 186

10.2.3　设计去氧核酶合成siRNA 186

10.2.4　体外酶切双链RNA法生产siRNA 191

10.3 DNA质粒载体表达的siRNA 193

10.3.1 Pol Ⅱ启动双链RNA表达 193

10.3.2 Pol Ⅲ启动siRNA表达 194

10.4　病毒载体携带的siRNA 195

10.4.1 肿瘤逆转录病毒载体表达siRNA/shRNA 195

10.4.2　腺病毒和腺相关病毒载体表达siRNA/shRNA 196

10.4.3　蔓病毒载体携带siRNA 197

11 RNA干扰技术在基因功能研究中的应用 202

11.1　基因组范围的基因功能系统性筛查 203

11.1.1 RNA干扰技术用于基因组功能筛查的程序 204

11.1.2 RNA干扰技术和正向遗传学技术 209

11.1.3 RNA干扰技术在系统性基因组功能筛查中的意义 211

11.2　基因干预动物模型与在体基因功能研究 212

11.2.1　利用基因打靶建立基因敲除鼠 213

11.2.2　转基因小鼠 215

11.2.3 RNA干扰的基因敲低鼠 217

12.1 高压静脉注射法导入siRNA 220

12　体内导入siRNA的技术 220

12.1.1　高压静脉注射法的靶器官 221

12.1.2　高压静脉注射法的原理 226

12.2　高压静脉注射法的临床应用雏型：隔离型肝脏灌注法 228

12.2.1　肝脏插管灌注方法的发展 228

12.2.2　隔离型肝脏灌注的原理和方法 229

12.2.3　隔离型肝脏灌注法的治疗效果 230

12.2.4　隔离型肝脏灌注法应用于导入siRNA的前景 231

12.3　提高体内siRNA生物稳定度的化学修饰方法 232

12.3.1 “加帽”的siRNA 232

12.3.2　硫代磷酸酯siRNA 233

12.3.3 甲基化和烯丙基化的siRNA 234

12.3.4　硼烷磷酸酯siRNA 234

12.4.1 应用胆固醇衍生物在肝脏导入siRNA 237

12.4　细胞选择性导入siRNA的方法 237

12.4.2　应用单链片段抗体技术选择性导入siRNA 239

13 RNA干扰技术在感染性疾病中的应用 243

13.1　病毒性肝炎的RNA干扰疗法 244

13.1.1 干扰丙型肝炎病毒基因 244

13.1.2　干扰乙型肝炎病毒基因 246

13.1.3　宿主肝细胞的Fas基因的RNA干扰 249

13.1.4　宿主肝脏细胞因子基因的RNA干扰 251

13.1.5　宿主肝细胞癌基因的RNA干扰 252

13.2 HIV感染的RNA干扰疗法 252

13.2.1 HIV感染人类靶细胞的周期 254

13.2.2 RNA干扰控制HIV感染 255

13.2.3 RNA干扰在治疗HIV感染中存在的问题和解决方法 260

13.2.4　抗HIV的RNA干扰药物开发的前景 264

14 RNA干扰技术在恶性肿瘤中的应用 266

14.1.1 Ras基因的RNA干扰 267

14.1　癌基因的RNA干扰 267

14.1.2 Her2基因的RNA干扰 271

14.2　丧失杂合性等位基因的RNA干扰 275

14.2.1 ASI抗肿瘤疗法的基本原理 276

14.2.2　逆基因药物应用于ASI的研究 278

14.3　肿瘤血管生成的RNA干扰 280

14.3.1 肿瘤血管形成的机制与肿瘤血管系统 280

14.3.2　血管生成因子的RNA干扰 282

14.4　肿瘤化疗耐药的RNA干扰 285

14.4.1 ABC转运蛋白的RNA干扰 286

14.4.2　谷胱甘肽转移酶与化疗耐药 288

14.4.3　抗凋亡基因的RNA干扰 289

实验1　体外siRNA单链的2′-ACE去保护和退火合成方法 292

附录　常用RNA干扰技术的实验方法 292

实验2 siRNA去盐和乙醇沉淀的方法 293

实验3　定量检测siRNA的方法 294

实验4 Klenow反应的方法 294

实验5　寡核苷酸和去氧核酶的鉴定 295

实验6　寡核苷酸模板的凝胶提纯方法 296

实验7　前体RNA的体外转录的方法 297

实验8　前体转录本的去氧核酶消化方法 298

实验9　消化产物定量和siRNA的制备方法 299

实验10　构建U6启动子启动的siRNA表达载体的方法 300

实验11　构建携带shRNA的蔓病毒的方法 302

实验12 RNA干扰基因敲低鼠模型的建立方法 303

参考文献 306