基因修饰小鼠制备常用技术PDF电子书下载

第1章 基因修饰动物概述 1

1.1 基因修饰动物的概念 1

1.1.1 转基因动物 2

1.1.2 基因敲除 2

1.1.3 基因捕获 5

1.1.4 其他理化因素引起的基因组修饰与基因修饰的区别 5

1.2 转基因动物的命名 6

1.2.1 转基因动物 6

1.2.2 基因敲除／敲入动物 8

1.2.3 条件性敲除小鼠的命名原则 9

1.2.4 基因捕获突变动物的命名原则 9

1.2.5 对携带遗传操作实体的品系和原种的命名规则 9

1.3 基因修饰动物技术的价值 10

1.3.1 使用小鼠做基因修饰研究的原因 10

1.3.2 基因修饰动物模型与细胞模型的区别 12

1.4 基因修饰的伦理学 13

1.4.1 基因修饰对动物的危害 13

1.4.2 环境和社会安全问题 14

1.4.3 基因修饰动物涉及的伦理学问题 15

1.5 基因修饰动物制备原理 15

1.5.1 生殖生物学原理 16

1.5.2 胚胎工程技术原理 19

1.5.3 基因修饰技术原理与进展 23

1.6 基因修饰技术发展趋势 47

第2章 原核注射法制备转基因小鼠 50

2.1 转基因载体的构建 50

2.1.1 目的基因序列优化设计与克隆 51

2.1.2 侧翼非翻译序列（UTR）和PolyA信号 53

2.1.3 选择合适的启动子 54

2.1.4 目的基因的连接 58

2.1.5 质粒载体的选择 58

2.1.6 注射前质粒的酶切与纯化 59

2.2 动物的准备 60

2.2.1 动物选择 60

2.2.2 超数排卵与卵的收集 62

2.3 原核注射 64

2.3.1 显微注射工作站 64

2.3.2 显微注射前的准备 66

2.3.3 显微注射 68

2.4 胚胎移植 69

2.4.1 输卵管移植 69

2.4.2 子宫角移植 73

2.5 阳性转基因小鼠检测 74

2.5.1 染色体水平的检测 74

2.5.2 转录水平的检测 76

2.5.3 翻译水平的检测 77

2.5.4 转基因小鼠整体表型观察 78

2.5.5 常规方法简介 78

2.6 讨论 82

2.6.1 转基因的总体效率 82

2.6.2 转基因在小鼠体内的整合及表达效率分析 83

第3章 基因敲除小鼠制备 91

3.1 载体构建 91

3.1.1 载体设计原则 91

3.1.2 筛选阳性细胞克隆的策略 93

3.1.3 载体的克隆 94

3.2 胚胎干细胞 96

3.2.1 ESC体外培养 96

3.2.2 同源重组ESC的鉴别 102

3.3 囊胚注射与胚胎移植 105

3.3.1 囊胚注射 105

3.3.2 胚胎移植 107

3.3.3 利用性别和毛色鉴别基因敲除鼠 108

3.4 注意事项 109

3.4.1 基因插入 109

3.4.2 基因敲除 110

3.4.3 大片段敲除 110

3.4.4 筛选基因的干扰 111

3.4.5 异常表型 111

3.4.6 遗传背景和修饰位点 111

3.4.7 基因冗余和代偿机制 112

3.4.8 补救方式 112

3.4.9 重组效率 112

3.4.1 0基因敲除策略的灵活运用 112

第4章 条件性基因敲除 114

4.1 位点专一性重组酶 114

4.1.1 Cre/LoxP系统 116

4.1.2 Flp/FRT系统 123

4.1.3 其他重组酶 124

4.2 小鼠条件性基因敲除 125

4.2.1 条件性敲除载体的设计 125

4.2.2 条件性同源重组敲除 126

4.2.3 RNA干扰 134

4.3 基因修饰小鼠可诱导表达系统 134

4.3.1 基于四环素依赖的调控系统 135

4.3.2 基于配体诱导重组酶系统的基因敲除 142

4.3.3 注意事项 146

第5章 基因捕获 150

5.1 基因捕获的类型及特点 150

5.1.1 基因捕获 152

5.1.2 启动子捕获 152

5.1.3 增强子捕获 154

5.1.4 PolyA捕获 154

5.1.5 可移除式外显子捕获 156

5.1.6 定向捕获 156

5.1.7 条件性基因捕获 156

5.2 基因捕获示例 159

5.2.1 捕获策略 159

5.2.2 RT-PCR法确认基因捕获载体的插入位点 160

5.2.3 利用X-Gal染色确认ESC中载体的插入位点 162

5.3 完成基因型鉴定 162

5.4 X-Gal染色鉴定胚胎、组织和切片中载体表达的特征 164

5.5 讨论及注意事项 165

5.5.1 载体的导入方法 165

5.5.2 重复捕获 165

5.5.3 基因捕获表达分析 166

5.5.4 表型缺失 166

5.5.5 突变基因的克隆和序列测定 166

5.5.6 突变的适应性 167

5.5.7 注意事项 167

第6章 CRISPR/Cas和TALEN系统敲除 169

6.1 CRISPR/Cas技术敲除 169

6.1.1 载体设计 169

6.1.2 敲除序列连接到pX260或pX330载体 171

6.1.3 敲除序列连接到gRNA cloning载体（Church Lab） 173

6.1.4 体外转录嵌合gRNA及Cas9 mRNA 174

6.1.5 一步法（原核注射法）实现（多）基因敲除 175

6.1.6 基因修饰检测 176

6.1.7 注意事项 177

6.2 TALEN技术敲除 177

6.2.1 载体设计 177

6.2.2 一步法构建载体操作步骤 181

6.2.3 TALEN的体外转录 188

6.2.4 制备基因敲除小鼠 188

6.2.5 注意事项 188

第7章 基因修饰小鼠繁育和保种 189

7.1 建立基因修饰小鼠品系 189

7.1.1 背景品系的选择 189

7.1.2 建立新品系基因修饰小鼠 190

7.2 基因修饰小鼠同类系育种策略 193

7.3 新的基因修饰品系的育种 194

7.3.1 成活率 194

7.3.2 生殖力 194

7.3.3 母性行为 194

7.3.4 寿命 194

7.3.5 基因型外显率 195

7.3.6 性连锁 195

7.4 基因修饰小鼠的表型分析 195

7.4.1 对照组选择 195

7.4.2 表型鉴定 195

7.5 福利评价 196

7.5.1 新生动物福利评价 197

7.5.2 离乳后福利评价 197

7.5.3 控制基因修饰小鼠繁殖数量的福利原则 198

7.6 影响小鼠育种的因素 200

7.6.1 垫料和产房材料 201

7.6.2 环境改善 201

7.6.3 食物供给 201

7.6.4 日常饲养 201

7.7 配子与胚胎保种 202

7.7.1 配子和胚胎冷冻 203

7.7.2 胚胎冷冻方法 205

7.7.3 精子冷冻保存方法 207

7.7.4 卵母细胞冷冻保存方法 208

7.7.5 卵巢组织冷冻保存方法 209

7.7.6 冷冻胚胎和配子的解冻 210

7.7.7 冷冻保存卵巢组织的解冻方法 212

7.8 体外受精方法 213

7.8.1 IVF培养皿的准备 213

7.8.2 精子样品的准备 213

7.8.3 卵母细胞的收集 214

7.8.4 受精卵的洗涤和培养 214

7.8.5 讨论与注意事项 215

参考文献 217