肾脏病学实验技术操作规程PDF电子书下载

第1章 细胞学实验技术 1

第一节 细胞培养 1

一、细胞复苏与冻存 1

二、原代近曲肾小管上皮细胞的分离培养 2

三、原代肾小球内皮细胞的分离培养 4

四、原代肾小球系膜细胞的分离培养 8

五、原代肾间质成纤维细胞的分离培养 10

六、足细胞培养 12

七、细胞共培养 15

八、成体干细胞培养技术（大鼠骨髓间充质干细胞） 16

九、细胞脂质体转染 20

十、肾脏细胞电转方法 21

十一、细胞原位杂交 23

第二节 流式细胞仪技术 26

一、普通细胞分选 27

二、细胞无菌分选 27

三、流式细胞仪检测细胞大小 29

四、流式细胞仪检测细胞周期 30

五、流式细胞仪检测细胞凋亡 32

第三节 共聚焦技术Ⅰ——细胞内蛋白质定位、细胞器及自噬体等亚细胞结构检测 36

一、共聚焦显微镜常规检测方法 36

二、细胞免疫荧光染色方法 38

三、细胞免疫荧光多重染色 38

四、细胞内脂肪颗粒染色及检测 40

五、细胞骨架蛋白染色及检测 41

六、细胞内质网染色及检测 43

七、细胞内线粒体染色及检测 44

八、细胞内溶酶体染色及检测 45

九、细胞内自噬体染色及检测 46

第四节 共聚焦技术Ⅱ——活体细胞内离子及功能的实时动态监测 47

一、活体细胞内离子动态检测常规方法 48

二、细胞胞浆及线粒体Ca2+的染色及检测 49

三、细胞内Na+染色及检测 51

四、细胞内pH染色及检测 51

五、细胞线粒体膜电位的染色及检测 53

六、细胞内活性氧（ROS）染色及检测 54

七、细胞内钙离子震荡及钙火花检测 56

八、荧光光漂白恢复（FRAP）技术检测细胞间通讯 58

九、荧光漂白丢失（FLIP）检测细胞膜蛋白的流动性及蛋白质核转位 60

十、荧光共振能量转移（FRET）检测蛋白质相互关系 62

十一、细胞X-Z纵切扫描检测极性细胞蛋白定位 64

十二、细胞及组织切片三维重建 66

第五节 共聚焦技术Ⅲ——荧光染料／探针标记样本存在的问题及分析对策 70

一、荧光标记样品需要注意的问题 70

二、荧光标记实验经常出现的问题及对策 71

三、典型举例 71

第六节 细胞实验其他技术 73

一、MTT测定细胞活力 73

二、细胞增殖测定（BrdU技术） 75

三、肾脏细胞微分离技术 76

四、亚细胞组分分离技术 78

第2章 分子生物学实验技术 82

第一节 核酸的提取与纯化 82

一、DNA的提取与纯化 82

二、RNA的提取与纯化 84

第二节 PCR技术 86

一、普通RT-PCR技术 87

二、实时荧光定量PCR技术 89

第三节 分子杂交 92

一、Southern blot 92

二、Northern blot 96

三、Western blot 98

第四节 基因克隆 102

一、酶切反应与DNA片段纯化 102

二、连接反应 103

三、转化 104

四、质粒的提取 105

第五节 RNAi实验原理与方法 108

一、RNAi的分子机制 108

二、siRNA的设计 108

三、siRNA的制备 109

四、siRNA的转染 111

第六节 MicroRNA实验技术 112

一、MicroRNA介绍 112

二、用MicroRNA芯片技术进行MicroRNA表达谱分析 113

三、MicroRNA表达水平的检测方法 115

四、MicroRNA靶基因的寻找 127

五、MicroRNA靶基因的鉴定 128

第七节 基因芯片 129

一、实验目的与主要实验原理 129

二、实验材料 129

三、实验步骤 129

四、结果示例 130

五、注意事项 130

第八节 荧光差异显示-双向电泳分析技术 130

一、蛋白质标记与双向电泳 131

二、差异蛋白质的鉴定 132

第九节 液相质谱联用技术 135

一、实验目的与主要实验原理 135

二、实验材料 135

三、实验步骤 135

四、注意事项 135

五、结果示例 136

第3章 病理学技术 138

第一节 常规病理技术 138

一、组织的取材与固定 138

二、石蜡包埋和塑料包埋技术 139

三、组织切片技术 140

四、常规染色技术（HE染色） 143

五、特殊染色技术 144

第二节 免疫病理技术 149

一、免疫组织化学染色 149

二、免疫组织化学双重染色 150

三、免疫荧光染色（直接法） 151

四、免疫荧光双重染色 153

五、微波石蜡切片免疫荧光标记 154

六、微波石蜡切片免疫荧光双（多重）标记 155

七、免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 156

第三节 分子病理技术 157

一、原位分子杂交的基本原理和过程 157

二、原位分子杂交的基本操作步骤 158

三、原位分子杂交与免疫组织化学双重染色 160

四、组织细胞凋亡检测 160

五、组织细胞凋亡与免疫组织化学双重染色 162

第四节 电镜技术 163

一、透射电镜介绍 163

二、透射电镜样品制备 163

三、透射电镜的使用 166

第五节 激光微切割技术 167

第4章 转基因技术 169

第一节 显微注射 170

一、目的DNA的制备 170

二、小鼠的准备和要求 170

三、输精管切除术 172

四、受精卵的分离 172

五、显微注射 174

六、受精卵移植 177

七、转基因小鼠的鉴定 180

八、技术成果 181

第二节 胚胎干细胞 183

第三节 逆转录病毒感染 183

一、原理 183

二、操作步骤 183

第四节 基因打靶技术 184

一、ES细胞的获得 184

二、基因载体的构建 184

三、基因打靶载体的导入 185

四、用选择性培养基筛选已击中的细胞 185

五、观察 185

第5章 肾脏疾病动物模型 186

第一节 血清病肾炎模型 186

一、动物 186

二、药品及试剂 186

三、造模 186

四、标本的留取与检测 187

第二节 Thy-1肾炎模型 188

一、实验目的 189

二、实验材料 189

三、实验步骤 189

四、结果示例 190

五、注意事项 190

第三节 Heymann肾炎 191

一、抗体制备 191

二、造模 193

第四节 阿霉素肾病模型 194

一、材料与方法 194

二、模型制作方法 194

三、检测项目与方法 194

四、结果示例 195

五、注意事项 195

第五节 抗肾小球基底膜肾炎模型 195

一、材料与方法 196

二、模型制作方法 196

三、检测项目与方法 196

四、结果示例 197

五、注意事项 197

第六节 庆大霉素所致急性肾小管坏死模型 197

一、材料与方法 197

二、模型制作方法 198

三、检测项目与方法 198

四、结果示例 198

五、注意事项 198

第七节 5/6肾切除模型 199

一、材料与方法 199

二、模型制作方法 199

三、检测项目与方法 199

四、结果示例 200

五、注意事项 200

第八节 LPS肾炎模型 201

一、器材及试剂准备 201

二、步骤 201

三、纤维蛋白免疫荧光染色 202

第九节 糖尿病肾病 203

一、器材及试剂准备 203

二、步骤 203

第十节 肾脏缺血再灌注损伤模型 205

一、实验动物选择及特殊器材 205

二、实验设计 205

三、实验步骤 205

四、病理结果 205

五、注意事项 205

第十一节 单侧输尿管梗阻模型 206

一、实验动物选择 206

二、实验设计 206

三、实验步骤 207

四、病理结果 207

五、注意事项 207

第十二节 肾移植 208

一、实验动物选择及特殊器材 208

二、实验设计 208

三、实验步骤 209

四、注意事项 209

第十三节 挤压伤肾损伤模型 210

一、肌内注射甘油溶液诱导横纹肌溶解AKI大鼠模型制备 210

二、重物压迫下肢肌肉诱导横纹肌溶解AKI大鼠模型 211

三、静脉注射骨骼肌匀浆（自体）诱导横纹肌溶解AKI大鼠模型 212

第十四节 肾脏发育模型 213

一、肾脏发育基因敲除模式 213

二、肾脏发育模型制备 214

第6章 电生理技术 217

一、实验目的 217

二、主要动物及仪器 217

三、方法及结果 218

四、注意事项 218

第7章 留取尿液方法 220

一、尿液标本的种类 220

二、尿液标本留取的注意事项 220

第8章 肾脏病生物样本资源库的建设规范 222

第一节 肾脏病临床信息数据库的建设 222

一、信息采集原则 222

二、信息采集流程 223

三、信息采集内容 224

四、随访信息采集 225

五、医学伦理学要求 225

六、人员岗位职责 225

第二节 肾脏病样本资源库操作规范 226

一、样本库建设原则 226

二、样本采集范围和分类 226

三、采样前准备 226

四、样本采集 227

五、样本处理 228

六、样本运输 229

七、样本储存 230

八、样本出入库管理 230

九、质量控制 230

十、实验室安全 231

十一、人员岗位职责 231

附录A 各实验室岗前培训内容 234

附录B 各实验室工作制度 238