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第一篇 概论 3

第一章 基因与基因组 3

第一节 基因的概念与特性 3

一、基因的概念与分子生物学定义 3

二、基因的一般特性 4

第二节 DNA的结构与性能 4

一、核酸的化学组成 4

二、DNA的分子结构 6

三、DNA的功能与性质 7

第三节 DNA的复制与表达 8

一、DNA复制 8

二、基因表达 8

第四节 基因组 10

一、病毒基因组 11

二、原核生物基因组 11

三、真核生物基因组 13

四、人类基因组 16

第一节 基因工程的基本概念 19

第二章 基因工程的基本概念、过程及研究策略 19

第二节 基因工程的基本过程及研究策略 20

一、目的DNA的制备 21

二、载体DNA及其改造 22

三、体外DNA重组 24

四、重组DNA的转化 25

五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增 27

六、目的DNA在受体细胞中的表达 29

第一节 基因工程发展的历史背景 31

第三章 基因工程的发展与应用 31

一、基因工程发展的关键性理论 33

二、基因工程的重大技术发明 33

第二节 基因工程的发展与应用 34

一、基因工程疫苗与DNA疫苗 34

二、基因诊断 34

三、基因治疗 35

四、基因工程药物 36

五、基因工程新技术的开发与应用 37

一、人类基因组计划 38

二、模式生物的基因组计划 38

第三节 人类基因组计划与后基因组时代 38

三、人类后基因组计划 39

第二篇 基因工程学的基本理论与技术 43

第四章 基因工程工具酶及其应用 43

第一节 限制性核酸内切酶 43

一、限制性核酸内切酶的命名原则 43

二、限制性核酸内切酶的分类 44

三、Ⅱ型限制酶的识别与切割序列 45

四、影响Ⅱ型限制酶作用的因素 48

五、限制性核酸内切酶在基因工程中的应用 49

第二节 DNA连接酶 50

一、DNA连接酶的分类及特性 50

二、连接酶催化DNA连接的机制 51

三、影响连接效率的因素 51

四、DNA连接酶在基因工程中的应用 52

第三节 反转录酶 52

一、AMV的生化特性 53

二、反转录酶催化DNA合成的分子机制 53

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及应用 54

第四节 DNA聚合酶 54

三、反转录酶在基因工程中的应用 54

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段酶 55

三、耐热DNA多聚酶 56

四、反转录酶 56

五、T4DNA聚合酶及T7DNA聚合酶 56

六、真核生物的DNA聚合酶 57

第五节 碱性磷酸酶 57

第六节 单链核酸内切酶——Sl核酸酶 58

第七节 末端脱氧核苷酸转移酶 58

二、末端转移酶在基因工程中的应用 59

一、末端转移酶的生物学功能 59

第五章 基因工程的克隆载体 61

第一节 概论 61

第二节 细菌质粒的生物学特性 62

一、质粒的定义 62

二、质粒的生物学特性 62

三、质粒的分类 63

第三节 质粒载体 63

一、概述 63

二、常用的质粒克隆载体 65

第四节 λ噬菌体载体 69

一、λ噬菌体 69

二、λ噬菌体载体 72

第五节 黏粒 76

一、基本特征 76

二、技术改进 77

第六节 M13噬菌体载体 78

一、野生型M13噬菌体的生物学特性 78

二、野生型M13噬菌体的改造 78

三、M13载体系列的优缺点 79

四、M13mp18/19的限制图谱和克隆位点序列 79

五、主要应用 80

六、受体细菌株 80

第七节 噬菌粒载体pUC118/119 80

一、基本特性 80

二、噬菌体载体pUC118和pUC119的主要特性 80

四、噬菌体载体pUC118/119的优点 81

三、辅助病毒M13K07 81

第六章 基因克隆 83

第一节 目的基因的获得 83

一、已知基因的获得 83

二、未知基因的获得 85

第二节 基因重组 88

一、黏末端连接 88

二、平端连接 89

三、同聚物加尾法 89

四、人工接头连接 90

五、T-A克隆 91

第三节 重组子导入受体菌 91

一、转化 92

二、感染 92

三、转染 92

第四节 目的基因序列克隆的筛选与鉴定 92

一、根据重组载体的标志作筛选 93

二、DNA限制性内切酶图谱分析 93

五、免疫学方法 94

六、核苷酸序列测定 94

四、PCR法 94

三、核酸杂交法 94

第七章 原核细胞表达系统 95

一、外源基因在原核细胞中的表达 95

二、影响外源基因在原核细胞中表达效率的主要因素 97

三、原核细胞表达载体的条件及特点 98

四、融合型表达载体 99

五、非融合型表达载体 100

六、分泌型表达载体 101

七、表达产物的检测 103

八、原核生物表达系统的应用措施及其局限性 104

第八章 真核生物表达系统 106

第一节 真核生物表达系统概述 106

一、真核生物表达系统的优势及必要性 106

二、真核生物基因结构及表达调控特点 106

三、真核生物表达系统 110

第二节 酵母表达系统 110

一、酵母载体 110

二、外源基因在酵母中的表达策略 112

一、哺乳动物细胞表达系统中的常用遗传标记 115

第三节 哺乳动物细胞表达系统 115

二、哺乳动物细胞表达载体 116

三、哺乳动物细胞基因转移方式 120

第四节 昆虫杆状病毒表达系统 122

一、昆虫杆状病毒载体 123

二、在昆虫细胞中表达外源基因 124

三、杆状病毒载体系统优势 125

一、PCR的基本原理 126

二、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响 126

第一节 PCR的基本原理和影响因素 126

第九章 聚合酶链反应 126

三、PCR标本的制备 130

四、PCR实验中常见问题及对策 131

第二节 常用的几种PCR技术 131

一、反转录PCR 131

二、定量PCR 132

三、实时荧光定量PCR 133

四、重组PCR 135

五、反向PCR 135

八、不对称PCR 136

六、多重PCR 136

七、长距离PCR 136

第三节 PCR的应用 137

一、PCR在分子生物学中的应用 137

二、PCR技术在临床医学中的应用 138

第十章 核酸杂交 140

第一节 核酸分子探针的标记 140

一、探针的种类及其选择 140

二、各种标记物及其选择 142

三、探针标记方法 144

一、核酸分子杂交的类型 148

第二节 核酸分子杂交的技术 148

二、核酸分子杂交的基本过程 150

第十一章 DNA测序 153

第一节 DNA序列测定的策略 153

一、从遗传图谱、物理图谱到基因组序列图谱 153

二、鸟枪法 154

三、引物延伸法 154

四、套式缺失法 154

一、Sanger双脱氧链终止法 155

第二节 常用的DNA测序方法 155

二、Maxam-Gilbert化学法测定DNA序列 157

三、DNA序列分析的自动化 159

四、其他的DNA测序方法 161

第三节 DNA测序中的常见问题 165

第四节 测序的意义 165

第十二章 生物芯片技术 166

一、生物芯片的概念 166

二、生物芯片的分类 166

三、生物芯片的基本工作原理 167

四、生物芯片的应用 172

五、存在问题及发展前景 178

第三篇 基因工程学的应用 183

第十三章 基因工程抗体 183

第一节 基因工程抗体概述 183

第二节 人源化抗体 184

一、人－鼠嵌合抗体 184

二、改型抗体 185

第三节 小分子抗体 186

二、单链抗体 187

一、Fab抗体 187

三、单域抗体 188

第四节 双特异性抗体 188

一、双特异性抗体的发展 188

二、BsAb的制备与构建 188

一、基本原理 189

二、噬菌体抗体库的分类 189

第五节 噬菌体抗体 189

三、噬菌体抗体的克隆和表达 190

四、噬菌体抗体的应用 191

五、展望 192

第十四章 真核生物基因表达调控 194

第一节 真核生物基因表达调控的基本理论 194

一、真核生物基因的结构功能特点 194

二、真核生物基因表达调控的策略 195

第二节 基因表达调控的研究方法 200

一、转录前表达调控的研究方法 200

二、转录水平调控的研究方法 201

第十五章 人类基因诊断与治疗 206

第一节 基因诊断 206

一、基因诊断的方法 206

二、基因诊断的疾病 207

第二节 基因治疗 207

一、基因治疗的类型 208

二、基因转移系统 208

三、受体细胞 211

四、基因治疗的应用 213

五、基因治疗的现状和展望 216

第十六章 DNA多态性 217

第一节 DNA多态性研究概述 217

一、限制性片段长度多态性 217

二、微卫星DNA 217

三、单核苷酸多态性 218

第二节 单核苷酸多态性 218

一、单核苷酸多态性的概念 218

二、SNP作为遗传标记的优势 219

三、单核苷酸多态性的研究意义 219

四、SNP检测方法 221

五、SNP的网上资源 222

第十七章 SEREX方法筛选功能基因 223

第一节 SEREX方法原理与技术步骤 223

一、SEREX方法原理 223

二、SEREX技术步骤 223

第二节 SEREX方法所筛选的肿瘤相关抗原基因 226

第十八章 基因敲除与转基因技术 227

第一节 基因敲除的原理 227

第二节 基因敲除的策略 227

三、基因敲除载体导入ES细胞 228

一、基因敲除载体的设计 228

二、基因敲除载体的构建 228

四、阳性细胞的筛选与鉴定 229

五、基因敲除动物的产生 231

第三节 基因敲除的应用及研究进展 231

一、基础研究 232

二、应用研究 232

三、研究进展 232

二、转基因技术的策略 233

第四节 转基因技术 233

一、转基因技术的基本原理 233

三、转基因技术的应用 236

第十九章 DNA疫苗 239

第一节 概述 239

一、定义 239

二、构建DNA疫苗的基本条件 239

三、DNA疫苗制备的基本步骤和方法 241

四、常用的DNA疫苗质粒表达载体 242

五、DNA疫苗的接种 243

第二节 DNA疫苗的免疫原理与应用 244

一、DNA疫苗的免疫原理 244

二、DNA疫苗的评价与优化 245

三、DNA疫苗的应用研究 246

第四篇 基因工程实验技术 251

实验一 碱变性法提取质粒DNA 251

一、质粒DNA的小量制备 252

二、质粒DNA的大量制备 252

实验二 DNA琼脂糖凝胶电泳 254

一、质粒DNA的小量酶切反应 256

实验三 DNA酶切及相对分子质量测定 256

二、相对分子质量测定 257

实验四 DNA的纯化、回收及定量 258

一、DNA的纯化 258

二、DNA的回收 259

三、DNA的定量及纯度测定 262

实验五 细胞总RNA的抽提 264

一、HBV基因扩增试剂盒检测标本中的HBVDNA 269

实验六 聚合酶链反应 269

二、RT-PCR（反转录－聚合酶链反应） 270

实验七 DNA的连接与转化 272

一、DNA连接 272

二、重组DNA的转化 273

实验八 重组子的筛选与鉴定 275

一、重组子的筛选法 275

二、重组子的鉴定 276

一、DNA探针标记与斑点杂交 278

实验九DNA探针标记及核酸杂交技术 278

二、Southern印迹杂交 281

三、Northern印迹杂交 282

实验十 从组织中提取人基因组DNA 284

实验十一 基因转染哺乳动物细胞 286

一、电穿孔法 286

二、脂质体介导的转染 287

实验十二 蛋白质印迹技术 289

实验十三 原位杂交 292

实验十四 PCR-SSCP技术 294

实验十五 核酸电镜技术 296

实验十六 表达谱DNA芯片样品的标记及杂交实验方案 298

附录 302

附录Ⅰ 常用玻璃器皿的处理 302

附录Ⅱ 常用培养基和溶液 303

附录Ⅲ 基因工程常用数据和换算计算公式 305

附录Ⅳ 人类基因组测序参加单位索引 309

附录Ⅴ 专业词汇（英中对照） 310

附录Ⅵ 常用专业名词与解释（英文） 315

附录Ⅶ 参考文献 328