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第一章 细胞与生物技术基础 1

第一节 细胞生物学 1

一、细胞生物学研究内容与现状 1

二、细胞生物学发展史 3

三、细胞生物学技术 4

第二节 细胞分子生物学 6

一、细胞分子生物学的发展 6

二、细胞分子生物学技术 6

第三节 细胞工程 7

一、基本概念 7

二、细胞工程的发展进程 7

三、细胞工程技术 7

四、展望 9

第二章 细胞显微观测技术 10

第一节 细胞显微技术 10

一、光学显微镜 10

二、电子显微镜 23

三、扫描探针显微镜 32

第二节 细胞超微标记示踪技术 38

一、电镜细胞化学 39

二、免疫电镜技术 51

三、电镜原位杂交技术 64

第三章 细胞检测技术 69

第一节 流式细胞仪检测技术 69

一、流式细胞仪的工作原理和基本操作 69

二、流式细胞术样品制备技术 71

三、细胞免疫荧光染色技术 74

四、细胞分选技术 77

第二节 细胞化学和免疫细胞化学 79

一、细胞化学 79

二、免疫细胞化学 85

第三节 细胞增殖与凋亡 100

一、细胞增殖 100

二、细胞凋亡 106

第四章 细胞的培养与分离技术 121

第一节 细胞培养基本方法和技术 121

一、细胞的原代培养 121

二、细胞的传代培养 124

三、细胞的冻存与复苏 125

四、细胞计数与成活率检测 126

五、培养物污染的判断及防止 127

第二节几种特殊细胞的培养与分离 130

一、神经元细胞的培养与分离 130

二、肝细胞的培养与分离 131

三、星状细胞的培养与分离 133

四、上皮细胞的培养与分离 135

五、内皮细胞的培养与分离 137

六、肿瘤细胞的培养与分离 138

第五章 细胞器的分离与制备技术 140

第一节 细胞膜 140

一、从悬浮细胞中制备细胞膜 140

二、从组织培养皿中的汇合或部分汇合细胞中分离顶层膜、基底膜或中间膜 142

三、从生长于微载体上的细胞中分离细胞膜 143

第二节 桥粒 144

一、从牛舌或牛口鼻部分离桥粒 144

二、分级分离桥粒 145

第三节 细胞质 145

一、网织红细胞和红细胞胞质液的制备 145

二、用培养细胞制备胞质液 146

第四节 线粒体 146

一、从肝脏中分离线粒体 147

二、从组织培养细胞中分离线粒体 147

第五节 高尔基体 148

一、从大鼠肝脏中分离高尔基复合体 148

二、从培养的哺乳动物细胞中分离高尔基体 149

第六节 粗微体 150

一、从狗的胰脏中制备粗微体 150

二、从组织培养细胞中制备粗微体 152

第七节 核糖体 154

第八节 细胞核 155

一、从肝脏组织中制备细胞核 155

二、用渗透溶胀法从H eLa细胞悬浮培养物中制备细胞核 156

三、活化剂裂解方法从悬浮培养的H eLa细胞中制备细胞核 157

第九节 细胞核基质 158

一、从培养细胞中制备细胞核基质 158

二、从组织中分离制备细胞核基质 159

第十节 核仁 160

一、从大鼠肝脏中分离核仁 160

二、从HeLa细胞中分离核仁 161

第十一节 微管 162

一、通过组装/解聚从缺少组装驱动成分的缓冲液中分离微管 163

二、在紫杉醇存在时通过组装的方法分离微管 164

第十二节 中间丝 164

一、从培养的细胞中分离Ⅰ～Ⅲ型中间丝 165

二、从组织中分离中间丝（从牛舌上皮分离角蛋白中间丝） 166

第六章 细胞的诱导分化技术 167

第一节 正常细胞的诱导分化 167

一、小鼠气管上皮细胞的诱导分化 167

二、视神经节细胞的诱导分化 169

第二节 肿瘤细胞的诱导分化 171

一、环腺苷酸对脑胶质瘤细胞的诱导分化 173

二、红景天苷对人肝癌细胞的诱导分化作用 174

三、5-氮杂脱氧胞苷增强苯丁酸钠对急性髓系白血病细胞的诱导分化 176

第三节 干细胞的诱导分化 177

一、胚胎干细胞的诱导分化 178

二、神经干细胞的诱导分化 179

三、髓造血干细胞的诱导分化 181

四、间充质干细胞的诱导分化 183

五、视网膜干细胞的诱导分化 184

六、表皮干细胞的诱导分化 186

七、肝脏干细胞的诱导分化 188

八、胰腺干细胞的诱导分化 189

九、肌肉干细胞的诱导分化 192

十、小肠黏膜干细胞的诱导分化 194

十一、肿瘤干细胞的诱导分化 196

第七章 干细胞分离与培养技术 198

第一节 胚胎干细胞 198

一、小鼠胚胎干细胞的分离培养 198

二、人胚胎干细胞的分离培养 199

三、饲养层细胞的分离 201

四、胚胎干细胞的传代 202

第二节 成体干细胞 204

一、人体MSC （hMSC）的培养 204

二、采用hMSC制作人工心脏瓣膜 205

三、采用hMSC制作人工骨 206

第八章 细胞内基因的导入 208

第一节 物理方法 209

一、电穿孔转染法 209

二、细胞显微注射技术 210

三、基因枪转染法 213

第二节 化学方法 214

一、磷酸钙沉淀法 214

二、脂质体介导DNA转染法 215

三、DEAE-葡聚糖转染法 216

四、阳离子聚合物转染法 216

第三节 生物方法 217

一、逆转录病毒载体转染法 217

二、腺病毒载体转染法 218

三、腺相关病毒载体转染法 219

第九章 哺乳动物细胞RNAi技术 221

第一节siRNA的设计 221

第二节siRNA的制备 228

一、化学合成方法 229

二、T7RNA聚合酶体外转录合成dsRNA和siRNA 230

三、用RNase Ⅲ消化长片段双链RNA制备siRNA 234

四、siRNA表达质粒载体和病毒载体 240

五、siRNA表达框 246

第三节siRN A导入哺乳动物细胞 247

一、脂质体 248

二、多肽-MPG转染 251

三、磁介导转染技术 253

第四节siRNA文库 255

一、随机siRNA文库 255

二、已知基因RNAi文库 258

第十章 细胞内基因的检测 262

第一节 外源基因表达的转录水平检测 262

一、Northern印迹技术 262

二、RT-PCR技术 265

三、实时定量PCR技术 267

第二节 外源基因表达的翻译水平检测 268

一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 269

二、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 272

三、蛋白质印迹 275

四、Eastern印迹 276

五、酶联免疫分析技术 277

六、免疫沉淀技术 279

七、蛋白质芯片技术 281

八、蛋白质生物功能测定法 282

第十一章 染色体检测技术 284

第一节 染色体标本的制备 284

一、染色体标本的常规制片方法 284

二、空气干燥法 284

第二节 细胞染色体显带技术 286

一、染色体C带分带技术 286

二、染色体G带分带技术 287

三、染色体Q带分带技术 288

四、染色体R带分带技术 288

五、姐妹染色单体分化染色技术 289

六、染色体银染方法 290

七、高分辨G带技术 291

第三节 细胞染色体的原位杂交 292

一、标本的制备技术 293

二、原位杂交技术 294

三、与染色体分带技术的结合 295

第十二章 细胞信号通路的检测方法 296

第一节 体内信号转导通路的检测——顺式报告系统 296

第二节 体内信号转导通道的检测——反式报告系统 299

第三节 化学免疫检测方法 302

第四节 磷酸化蛋白激酶免疫沉淀检测 303

第十三章 细胞与重组病毒载体的生产 306

第一节 腺病毒的制备方法 306

一、腺病毒制备系统的概述 306

二、细胞内同源重组法制备腺病毒载体 306

三、细胞外同源重组法制备腺病毒载体 308

四、腺病毒载体的大规模扩增 310

五、重组腺病毒的鉴定 311

第二节 腺相关病毒的制备方法 313

一、293细胞/三质粒生产系统 314

二、AAV包装细胞系的建立和AAV的生产 316

三、AAV生产细胞系系统 318

四、 rHSV辅助质粒生产系统 321

第三节 单纯疱疹病毒载体的制备 323

一、辅助病毒依赖性HSV扩增子载体生产工艺 323

二、以黏粒为基础生产重组单纯疱疹病毒 324

三、Cre-loxP重组系统生产HSV-1扩增子载体 327

四、利用微载体生产重组单纯疱疹病毒载体 330

五、利用生物反应器规模化生产重组HSV载体 332

第四节 逆转录病毒载体制备方法 334

一、依赖于包装细胞系的稳定生产方法 334

二、多质粒共转染的瞬时生产方法 337

第十四章 细胞融合与单克隆抗体 338

第一节 细胞融合 338

一、细胞融合技术 338

二、杂交细胞的筛选 341

第二节 单克隆抗体的生产技术 345

一、动物的选择以及免疫 345

二、杂交瘤细胞的融合与筛选 347

三、单克隆抗体的筛选检测 350

四、杂交瘤细胞的克隆化培养 355

五、杂交瘤细胞鉴定、冻存与复苏 357

六、单克隆抗体的大量制备 359

七、单克隆抗体的纯化 360

八、单克隆抗体的鉴定 361

九、单克隆抗体的标记 364

第十五章 治疗性克隆技术 369

第一节 细胞核移植技术 370

一、罗斯林技术 370

二、檀香山技术 372

第二节 体细胞重编程技术 373

一、体细胞与多能干细胞融合技术 373

二、体细胞与多能干细胞的提取物共孵育技术 373

三、特定基因的表达诱导技术 375

第十六章 细胞生物技术的应用 379

第一节 医疗检测 379

一、分子生物学检测技术 379

二、免疫学检测技术 386

第二节 细胞大规模高效培养技术的工业应用 388

一、疫苗的生产 388

二、基因重组蛋白药物的生产 390

第三节 干细胞移植在疾病治疗中的应用 392

一、BDNF（脑源性神经营养因子）基因修饰的人骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病 392

二、hIGF-1基因修饰骨髓间充质干细胞移植修复兔关节软骨缺损 400

三、骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死 406

四、人胰腺干细胞在糖尿病治疗中的应用 411

参考文献 416