第1章 基因工程概述 1
1.1基因工程的定义 2
1.2基因工程的诞生和发展 2
基因工程的诞生 2
基因工程的发展 3
1.3基因工程研究的主要内容 4
基因工程的基本过程 4
基因工程研究的主要内容 5
1.4基因工程的研究意义 5
基因工程技术在医学领域中的应用 5
基因工程在农业领域中的应用 7
基因工程在工业领域中的应用 8
第2章 基因工程操作的工具酶 10
2.1限制性核酸内切酶 10
限制性核酸内切酶的发现 10
限制性核酸内切酶的分类 11
限制性核酸内切酶的命名以及识别特点 11
Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式 12
Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件 14
影响限制性核酸内切酶活性的因素 14
2.2 DNA连接酶 15
连接机理 15
DNA连接酶的种类 16
DNA连接酶的反应体系 16
影响连接反应的因素 16
2.3 DNA聚合酶 17
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 17
Klenow片段 17
T4噬菌体DNA聚合酶 18
T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶 18
Taq DNA聚合酶 18
逆转录酶 18
2.4末端脱氧核苷酸转移酶 19
2.5 S1核酸酶 19
2.6核酸外切酶 19
2.7 T4噬菌体多核苷酸激酶 20
2.8碱性磷酸酶 20
第3章 基因工程载体 22
3.1质粒载体 22
质粒的基本特性 23
质粒载体的必备条件 24
常用的质粒载体类型 25
3.2 λ噬菌体载体 27
λ噬菌体的生物学特性 27
常见的λ噬菌体载体的构建 28
常见的λ噬菌体载体 29
3.3单链DNA噬菌体载体 29
M13噬菌体的生物学特性 30
常见的M13噬菌体载体 31
3.4噬菌粒载体 31
3.5黏粒载体 31
黏粒载体的基本特点 32
黏粒载体的构建 32
黏粒载体在基因克隆中的应用 32
常用的黏粒载体及应用 33
3.6人工染色体 33
酵母人工染色体 33
细菌人工染色体 34
哺乳动物人工染色体 34
3.7植物基因工程载体 34
质粒转化载体 35
植物病毒转化载体 35
3.8动物基因工程载体 36
SV40病毒载体 36
反转录病毒载体 37
痘苗病毒载体 37
腺病毒载体 38
第4章 基因工程基本操作技术 39
4.1核酸的提取与纯化 39
核酸提取与纯化的基本原理 40
植物细胞核DNA的提取 41
核外DNA的提取 43
RNA的提取 45
核酸的纯化 47
4.2核酸的检测与保存 48
核酸的检测 48
核酸的保存 49
4.3核酸的凝胶电泳 50
琼脂糖凝胶电泳 51
聚丙烯酰胺凝胶电泳 53
4.4分子杂交技术 55
变性和复性 55
探针与探针的制备 56
Southern杂交 58
Northern杂交 60
Western杂交 61
4.5核酸的序列分析技术 62
Maxam-Gilbert碱基顺序分析法 62
Sanger碱基顺序分析法 63
自动化测序法 65
4.6核酸和蛋白互作研究技术 65
酵母双杂交技术 65
酵母单杂交技术 67
噬菌体展示技术 68
DNA迁移率变动试验 68
DNaseⅠ足迹试验 69
4.7通路克隆—Gateway技术 69
4.8 RNA干扰技术 70
siRNA干扰机理 70
siRNA的合成 71
细胞和整体生物导入siRNA的方法 71
第5章 聚合酶链反应及其相关技术 73
5.1 PCR技术的原理 73
聚合酶链反应操作过程 74
参与PCR反应的成分及其作用 75
聚合酶链反应的条件 79
聚合酶链反应引物设计原则 80
5.2聚合酶链反应技术类型 81
已知DNA序列的聚合酶链反应扩增 81
逆转录聚合酶链反应 81
已知cDNA一段序列获得全长cDNA的聚合酶链反应 83
已知序列侧翼聚合酶链反应扩增 84
未知序列聚合酶链反应扩增 86
聚合酶链反应技术应用 90
5.4荧光定量PCR技术 90
荧光PCR的特点 90
实时荧光定量PCR技术原理 91
荧光探针和荧光染料 92
第6章 基因文库的构建 97
6.1基因组DNA文库的构建 97
基因组文库的完备性 98
基因组DNA文库的构建 98
6.2 cDNA文库的构建 99
cDNA文库的构建 100
6.3 DNA文库的保存 101
第7章 DNA体外重组与重组体的筛选鉴定 103
7.1目的基因与质粒载体的连接 103
黏性末端的DNA片段的连接 103
平末端连接法 104
7.2重组克隆载体引入受体细胞 105
7.3重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染 106
磷酸钙和DNA共沉淀物转染法 106
DEAE-葡聚糖介导转染法 106
利用聚季铵盐的DNA转染法 106
电穿孔法DNA转染 107
7.4重组子的筛选与鉴定 107
7.5物理检测法 110
凝胶电泳检测法 111
R-环检测法 112
7.6核酸分子杂交检测法 112
菌落印迹原位杂交 113
斑点印迹杂交 113
Southern印迹杂交 113
7.7免疫化学检测法 114
放射性抗体检测法 114
免疫沉淀检测法 115
7.8核酸序列测序分析法 115
7.9报告基因检测法 115
新霉素磷酸转移酶基因 116
双氢叶酸脱氢酶基因 116
潮霉素磷酸转移酶基因 116
氯霉素乙酰转移酶基因 116
冠瘿碱合成酶基因 116
β-葡萄糖苷酸酶基因 117
荧光素酶基因 117
第8章 外源基因在大肠杆菌中的表达 119
8.1外源基因正确表达的基本条件 120
启动子 120
转录终止子 123
核糖体结合位点 123
密码子偏好 124
8.2常用的大肠杆菌表达载体 125
Lac启动子的表达载体 126
trp启动子和tac启动子的表达载体 127
PL启动子表达载体 129
T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达载体系统 132
8.3外源蛋白质表达部位 133
细胞质表达 133
细胞外周质表达 136
细胞外分泌 137
融合蛋白 138
8.4提高外源基因表达效率的方法 140
外源基因的有效转录与外源基因高效表达 140
转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达 141
有效的翻译起始与外源基因高效表达 141
终止密码子选择与外源基因高效表达 142
外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达 142
8.5表达产物的检测 143
含有报告基因的融合蛋白表达的检测 143
免疫技术 143
Western杂交 144
第9章 酵母菌和丝状真菌基因工程 145
9.1酵母菌的基因工程 145
酵母菌的宿主系统 145
酵母菌的载体系统 149
酵母菌的转化系统 151
常用的酵母表达系统 154
酵母菌的蛋白修饰分泌系统 158
9.2丝状真菌的基因工程 161
丝状真菌 161
丝状真菌的DNA遗传转化系统 162
丝状真菌载体质粒的构建 164
外源蛋白在丝状真菌的表达 166
第10章 转基因植物 168
10.1目的基因的分离和鉴定 168
人工合成 168
序列克隆法 168
功能克隆法 169
差异表达分析法 170
10.2植物表达载体——启动子 170
组成型启动子 170
组织特异性启动子 171
诱导型启动子 172
10.3目的基因的转化方法 173
间接转化法 173
直接转化法 174
10.4转基因植物的筛选与检测 175
转基因植物的筛选 176
外源基因表达的检测 176
10.5转基因植物中外源基因的沉默 179
转录水平上的外源基因沉默（TGS） 179
转录后水平上外源基因的沉默（PTGS） 180
10.6植物转基因沉默防止与抑制策略 181
转化前防止策略 181
转化后抑制策略 183
10.7转基因植物的安全性和对策 183
抗性标记基因的剔除技术 184
安全标记基因 185
无标记基因的安全策略 185
10.8转基因植物的应用 186
转基因植物的应用 186
转基因植物研究发展趋势 187
第11章 转基因动物 190
11.1生产转基因动物的关键技术 190
原核显微注射法 190
胚胎干细胞法 191
逆转录病毒感染法 191
精子载体法 192
体细胞核移植法 193
转基因技术与其他生物新技术的结合 193
11.2转基因动物的检测 194
染色体和基因水平 194
转录水平 194
翻译水平 195
其他 196
11.3转基因动物技术存在的问题 196
外源目的基因在宿主基因组中的行为难以控制 196
转基因动物技术给动物带来的危害 197
转基因动物的成功率和成活率极低，生产成本高 197
转基因动物的安全性问题 197
11.4提高外源目的基因的整合效率和表达水平的方法 198
外源目的基因的整合效率和定位 198
外源目的基因的高效表达及调控元件 199
11.5转基因动物乳腺生物反应器 200
11.6转基因动物的应用 201
建立诊断和治疗人类疾病的动物模型 201
用转基因动物生产药用蛋白 201
生产可用于人体器官移植的动物器官 202
基因动物在培养家畜新品种方面的应用 202
展望 202
第12章 转基因生物安全 204
12.1基因工程实验室安全性的基本要求 204
基因工程实验室重组DNA存在的潜在危害 204
基因工程安全等级的划分及安全控制措施 205
12.2基因工程产品释放的规则及要求 206
基因工程药物投放的规则和要求 206
转基因植物品种的释放要求 207
ISO认证 208
12.3现代生物技术专利 208
12.4基因工程产品的安全性问题 210
环境安全性 210
转基因食品安全性问题 212
主要参考文献 214