第1章 RNA与细胞生物学 1
1.1 为什么研究RNA 1
1.2 RNA是什么 2
1.3 多核苷酸的合成 3
1.4 RNA的种类 5
1.5 严谨度——影响核酸结构的条件 5
1.5.1 盐对严谨度的影响 6
1.5.2 pH对严谨度的影响 6
1.5.3 温度对严谨度的影响 7
1.5.4 甲酰胺对严谨度的影响 7
1.6 双链分子的类型 7
1.7 参考文献 8
第2章 真核基因的转录与组织 9
2.1 转录和中心法则 9
2.1.1 调控元件 10
2.1.2 DNA模板 11
2.2 基因组织 11
2.3 RNA聚合酶和转录产物 13
2.4 参考文献 15
第3章 信使RNA 17
3.1 典型mRNA分子的拓扑结构 17
3.1.1 5′帽子 17
3.1.2 前导序列 18
3.1.3 编码区 19
3.1.4 尾部序列 19
3.1.5 聚腺苷尾 19
3.1.6 细胞器mRNA 21
3.2 细胞质内的稳定性 21
3.3 调控水平 21
3.4 参考文献 22
第4章 核糖核酸酶 26
4.1 基本原理 26
4.2 核糖核酸酶活性的消除 26
4.3 核糖核酸酶抑制剂的种类 27
4.3.1 特异性RNase抑制剂 27
4.3.2 非特异性RNase抑制剂 28
4.4 器皿和试剂的准备 29
4.4.1 二乙基焦碳酸酯 30
4.4.2 替代方法——用消毒水冲洗 31
4.4.3 过氧化氢 31
4.4.4 氢氧化钠和十二烷基硫酸钠 31
4.5 控制核酸酶活性的其他试剂 32
4.5.1 盐酸胍 32
4.5.2 硫氰酸胍 32
4.5.3 十二烷基硫酸钠 32
4.5.4 N-十二烷基肌氨酸钠 32
4.5.5 苯酚∶氯仿∶异戊醇 32
4.5.6 8-羟基喹啉 33
4.5.7 氯化铯 33
4.5.8 三氟乙酸铯 33
4.5.9 蛋白酶K 34
4.5.10 RNAlater（RNA保护剂） 34
4.6 实验方案：氧钒核糖核苷复合物的合成 34
4.7 参考文献 35
第5章 RNA分离策略 37
5.1 基本原理 37
5.2 RNA纯化的目的 38
5.3 裂解缓冲液的组成 40
5.3.1 温和的裂解缓冲液 40
5.3.2 离液裂解缓冲液 44
5.4 用含有胍离子的缓冲液分离RNA 45
5.5 胍-酸-酚抽提技术 46
5.5.1 实验方案：胍-酸-酚抽提 46
5.6 密度梯度离心 47
5.6.1 氯化铯 47
5.6.2 三氟乙酸铯 50
5.7 同时分离RNA和DNA 53
5.7.1 实验方案：同时分离RNA和DNA 53
5.8 试剂盒 55
5.8.1 硅胶技术 55
5.9 其他方法 56
5.9.1 实验方案：用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA 56
5.9.2 实验方案：原核RNA的分离 57
5.9.3 实验方案：酵母RNA的分离 58
5.10 纯化RNA的短期保存和长期保存 59
5.11 参考文献 60
第6章 从组织中提取RNA 62
6.1 基本原理 62
6.2 组织培养或组织 62
6.2.1 细胞培养的优点 63
6.2.2 组织样品的优点 63
6.3 匀浆方法 63
6.3.1 Polytron破碎 64
6.3.2 杜恩斯匀浆 64
6.4 从不同器官和组织分离RNA的方法 65
6.4.1 新鲜组织 65
6.4.2 冷冻组织 66
6.4.3 固定组织 67
6.5 实验方案：用氯化锂-尿素法从组织分离RNA 67
6.6 实验方案：从富含脂类的组织分离RNA 69
6.7 纯化嵌合在多核糖体的mRNA 70
6.7.1 实验方案：嵌入多核糖体的mRNA的提取 71
6.8 实地采集生物样品 72
6.9 RNA“净化”方法 73
6.10 参考文献 73
第7章 多聚腺苷酸RNA的分离 76
7.1 基本原理 76
7.2 多聚腺苷酸化 77
7.3 poly（A）的解释说明 77
7.4 多聚腺苷酸化mRNA的分离 79
7.5 用磁珠技术纯化poly(A)+RNA 80
7.5.1 实验方案：用磁珠纯化poly(A)+RNA 81
7.6 oligo（dT）纤维素柱层析 83
7.6.1 实验方案：生理量的poly(A)+RNA纯化 84
7.7 快速非柱式纯化poly(A)+RNA 87
7.7.1 实验方案：快速非柱式纯化poly(A)+RNA 87
7.8 参考文献 88
第8章 RNA制备的质量控制 90
8.1 基本原理 90
8.2 质量控制技术1：RNA的电泳检测 90
8.2.1 实验方案 92
8.3 质量控制技术2：紫外吸收光谱和吸收峰比值 92
8.3.1 核酸浓度和纯度的鉴定 93
8.4 质量控制技术3：RNA样品进行RT-PCR 96
8.5 质量控制技术4：Northern分析 96
8.6 质量控制技术5：RNA样品进行体外翻译 97
8.7 参考文献 97
第9章 斑点印迹分析 98
9.1 基本原理 98
9.2 斑点印迹的优点和缺点 99
9.3 合适的阴性对照和阳性对照 100
9.3.1 实验方案：RNA斑点印迹 100
9.3.2 实验方案：DNA斑点印迹 101
9.4 斑点印迹数据的局限性 102
9.5 参考文献 103
第10章 电泳 104
10.1 基本原理 104
10.2 核酸的标准化 104
10.2.1 实验方案：poly（A）的标准化 106
10.3 琼脂糖凝胶电泳中RNA样品变性方法 108
10.3.1 甲醛变性法 109
10.3.2 实验方案：甲醛变性胶 110
10.3.3 乙二醛／二甲基亚砜变性法 111
10.3.4 实验方案：乙二醛化与RNA电泳 112
10.4 分子量标准 113
10.4.1 分子量标准的正确使用 114
10.4.2 核糖体RNA 115
10.5 凝胶染色技术 119
10.5.1 溴化乙锭 119
10.5.2 SYBR绿 121
10.5.3 SYBR金 122
10.5.4 GelStar 122
10.5.5 银染 122
10.5.6 吖啶橙 123
10.5.7 亚甲基蓝 123
10.6 电泳过程中的安全问题 124
10.7 电泳仪器的维护 124
10.8 第一次进行琼脂糖凝胶电泳时的几点提示 125
10.8.1 基本术语 125
10.8.2 注意事项 125
10.9 参考文献 127
第11章 照片文档和图像分析 130
11.1 基本原理 130
11.2 照片文档 130
11.2.1 样本可视化 131
11.2.2 色彩过滤 132
11.2.3 安全第一 133
11.2.4 优化电泳图的一些小技巧 133
11.2.5 照相技术和X射线胶片固有的局限性 136
11.3 数字图像分析 136
11.3.1 图像格式 139
11.3.2 实践中需要考虑的问题 139
11.4 参考文献 141
第12章 Northern印迹分析 142
12.1 基本原理 142
12.2 滤膜的选取 142
12.2.1 硝酸纤维素膜 143
12.2.2 尼龙膜 143
12.2.3 聚偏二氟乙烯膜 144
12.3 膜的准备和取用 144
12.4 Northern转膜技术 145
12.4.1 毛细转膜法 145
12.4.2 涡轮印迹器 146
12.4.3 真空印迹法 146
12.4.4 正压转膜法 146
12.4.5 电转印迹法 146
12.4.6 碱印迹法 147
12.4.7 实验方案：用被动毛细扩散法转移RNA 147
12.4.8 实验方案：用涡轮印迹器向下转移RNA 149
12.5 转膜后膜的处理 150
12.5.1 甲醛变性系统 150
12.5.2 乙二醛变性系统 151
12.6 固定技术 151
12.6.1 烘烤 151
12.6.2 紫外线照射交联 151
12.6.3 实验方案：将RNA紫外交联于尼龙膜上 152
12.7 固定后膜的处理 152
12.8 参考文献 153
第13章 核酸探针技术 154
13.1 基本原理 154
13.2 探针的分类 155
13.3 标记系统的选择 155
13.3.1 同位素标记 156
13.3.2 非同位素标记 159
13.4 DNA探针 161
13.4.1 DNA探针的合成 162
13.5 反义RNA探针 164
13.5.1 RNA探针的特点 166
13.5.2 RNA探针的合成 166
13.6 探针的纯化 167
13.7 探针的保存 168
13.8 内源参照物 168
13.9 参考文献 170
第14章 核酸杂交应用 172
14.1 基本原理 172
14.2 影响杂交动力学和特异性的因素 172
14.2.1 温度 173
14.2.2 离子强度 173
14.2.3 pH 174
14.2.4 探针长度 174
14.2.5 探针浓度 174
14.2.6 （G+C）含量 174
14.2.7 错配 175
14.2.8 探针的复杂性 175
14.2.9 黏性 175
14.2.10 甲酰胺 176
14.3 杂交温度 176
14.3.1 长探针的Tm值计算 176
14.3.2 寡核苷酸探针的Tm值计算 176
14.4 杂交和Northern分析 177
14.4.1 预杂交：滤膜处理 177
14.4.2 实验方案：预杂交（长探针） 178
14.4.3 探针变性 178
14.4.4 杂交 179
14.4.5 杂交后严格洗涤 179
14.5 参考文献 179
第15章 检测原理 181
15.1 基本原理 181
15.2 放射自显影 182
15.2.1 滤膜的处理 183
15.2.2 X射线胶片 183
15.2.3 安全灯 184
15.2.4 曝光时间 185
15.2.5 增感屏 185
15.2.6 荧光成像法 186
15.2.7 胶片预闪 186
15.2.8 暗盒的规格 186
15.2.9 显影与定影 187
15.2.10 放射自显影：推荐方案 187
15.3 非同位素方法 188
15.3.1 生物素 189
15.3.2 地高辛 190
15.3.3 荧光标记的核苷酸 190
15.3.4 直接酶标法 191
15.3.5 化学发光检测法 191
15.3.6 显色检测法 193
15.4 数字成像系统 193
15.5 参考文献 194
第16章 核酸酶保护法定量测定特定的mRNA 196
16.1 基本原理 196
16.2 基本方法 198
16.3 探针选择 200
16.4 优化建议 202
16.5 可能的困难 203
16.6 实验方案：S1核酸酶保护分析法定量转录产物 204
16.7 实验方案：RNase保护分析法定量转录产物 206
16.8 参考文献 208
第17章 核RNA分析 210
17.1 基本原理 210
17.2 转录速率的检测 210
17.3 实验方案：核逃逸实验（新生mRNA分析技术） 213
17.3.1 细胞收集及细胞核的制备 213
17.3.2 用NP-40缓冲液裂解细胞 214
17.3.3 细胞核制备的备选方案：从组织培养的细胞中分离易损细胞核 214
17.3.4 细胞核制备的备选方案：从完整组织中分离细胞核 215
17.3.5 转录物的标记 216
17.3.6 标记转录物的回收 217
17.3.7 靶DNA的制备 218
17.3.8 用于杂交的RNA的制备 219
17.3.9 杂交后的洗脱和检测 220
17.4 实验方案：核逃逸实验（备选方法） 220
17.5 实验方案：核酸酶保护和脉冲标记转录法 222
17.6 RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ活性的区分 223
17.7 提取用于稳态分析的核RNA 224
17.8 实验方案：直接分离核RNA 225
17.9 实验方案：从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA 226
17.10 参考文献 227
第18章 cDNA合成 229
18.1 基本原理 229
18.2 cDNA合成概述 229
18.2.1 第一链合成的注意事项 231
18.2.2 第二链合成的注意事项 235
18.3 核定cDNA合成的效率 237
18.4 连接的注意事项 237
18.5 参考文献 238
第19章 反转录聚合酶链反应 239
19.1 基本原理 239
19.2 聚合酶链反应概述 239
19.3 反转录聚合酶链反应基本方法 243
19.4 实验室设计 246
19.5 引物设计 246
19.5.1 基本标准 250
19.5.2 Tm值 251
19.6 优化程序 252
19.7 PCR产物的分析 256
19.8 RT-PCR质量监控点 256
19.9 相关技术 258
19.9.1 cDNA 5′末端快速扩增PCR 258
19.9.2 cDNA 3′末端快速扩增PCR 260
19.9.3 巢式PCR 261
19.10 实验方案：cDNA第一链的合成 261
19.11 实验方案：PCR反应扩增cDNA 262
19.12 PCR产物的克隆 263
19.13 实验方案：平末端PCR产物的末端加A 264
19.14 实验方案：TA克隆的连接反应 264
19.15 TOPO克隆 266
19.16 参考文献 266
第20章 定量PCR技术 268
20.1 基本原理 268
20.2 灵敏度指标 268
20.3 定量方法 269
20.4 内源参照物 270
20.5 外源参照物 272
20.6 对照反应的规划 273
20.7 关于负对照 276
20.8 竞争PCR的关键因素 276
20.9 竞争PCR的主要步骤 280
20.10 实验方案：竞争PCR 281
20.10.1 非同源竞争模板的合成 282
20.10.2 第一链cDNA的合成 283
20.10.3 竞争PCR（初级扩增） 283
20.10.4 竞争PCR（次级扩增） 285
20.11 关于图像分析的考虑 286
20.12 竞争PCR的问题解答 287
20.13 实时PCR 289
20.14 参考文献 292
第21章 转录差减法 296
21.1 基本原理 296
21.2 关键问题 297
21.3 差减-校正PCR 298
21.4 非PCR差减 302
21.5 差减法的问题与解决办法 303
21.6 参考文献 305
第22章 mRNA差异显示 307
22.1 基本原理 307
22.2 一般过程 307
22.3 物的多样性：预期得到什么 314
22.4 实验方案：mRNA差异显示 316
22.4.1 cDNA的合成 316
22.4.2 通过PCR扩增cDNA的各个组分 316
22.4.3 PCR产物分析 317
22.5 实验方案：差异表达序列的鉴定和筛选 319
22.6 用亲和俘获回收差异表达的序列 320
22.7 PCR产物的克隆 320
22.8 差异表达的验证 321
22.9 进一步的鉴定 321
22.10 差异显示的应用 322
22.11 mRNA差异显示的问题与解决方法 322
22.12 参考文献 324
第23章 基因表达的高通量分析 326
23.1 基本原理 326
23.2 微阵列是什么 326
23.3 微阵列能做什么 327
23.4 微阵列不能做什么 329
23.5 微阵列分析的主要步骤 329
23.6 参比RNA 331
23.7 应用 331
23.8 参考文献 332
第24章 RNA干扰——目标基因的沉默 333
24.1 基本原理 333
24.2 重要的RNAi术语 334
24.3 RNAi是如何工作的 335
24.3.1 siRNA的导入途径 336
24.3.2 shRNA的导入方法 337
24.3.3 DNA指导的RNAi技术 338
24.3.4 siRNA导入哺乳动物细胞的技术 339
24.4 有效的siRNA设计 339
24.5 体外和体内的问题 340
24.6 参考文献 342
第25章 基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学 345
25.1 基本原理 345
25.2 重要术语 346
25.3 基因组与基因组学 346
25.4 转录组与转录组学 347
25.5 蛋白质组与蛋白质组学 348
25.6 生物信息学 349
25.7 参考文献 351
第26章 一个RNA范例 352
26.1 典型实验 353
26.2 灵敏度的问题 355
26.3 有待进行的 355
26.4 到哪儿去寻求帮助 357
尾声 358
智慧的结晶 358
附录 362
附录1 保存完整和准确的记录 362
附录2 储存液 363
附录3 苯酚的制备 367
附录4 溴化乙锭和SYBR绿溶液的处置 369
附录5 用DNaseⅠ去除RNA样品中的DNA 371
附录6 用RNase去除DNA样品中的RNA 372
附录7 甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子化 373
附录8 硅烷化离心管和玻璃器皿 373
附录9 分子生物学家的主流工具——离心法 373
附录10 胰蛋白酶消化贴壁细胞的方法 377
附录11 用盐析法分离高分子量DNA 378
附录12 从植物组织中分离RNA 380
附录13 电泳——原理、参数和安全 380
附录14 聚丙烯酰胺凝胶电泳 388
附录15 仪器、试剂和服务的供应商 389
附录16 SI词头 393
附录17 通用缩写 393
附录18 商标引用 394
术语表 397
索引 409