RNA分离与鉴定实验指南：RNA研究方法 原著第3版PDF电子书下载

第1章 RNA与细胞生物学 1

1.1 为什么研究RNA 1

1.2 RNA是什么 2

1.3 多核苷酸的合成 3

1.4 RNA的种类 5

1.5 严谨度——影响核酸结构的条件 5

1.5.1 盐对严谨度的影响 6

1.5.2 pH对严谨度的影响 6

1.5.3 温度对严谨度的影响 7

1.5.4 甲酰胺对严谨度的影响 7

1.6 双链分子的类型 7

1.7 参考文献 8

第2章 真核基因的转录与组织 9

2.1 转录和中心法则 9

2.1.1 调控元件 10

2.1.2 DNA模板 11

2.2 基因组织 11

2.3 RNA聚合酶和转录产物 13

2.4 参考文献 15

第3章 信使RNA 17

3.1 典型mRNA分子的拓扑结构 17

3.1.1 5′帽子 17

3.1.2 前导序列 18

3.1.3 编码区 19

3.1.4 尾部序列 19

3.1.5 聚腺苷尾 19

3.1.6 细胞器mRNA 21

3.2 细胞质内的稳定性 21

3.3 调控水平 21

3.4 参考文献 22

第4章 核糖核酸酶 26

4.1 基本原理 26

4.2 核糖核酸酶活性的消除 26

4.3 核糖核酸酶抑制剂的种类 27

4.3.1 特异性RNase抑制剂 27

4.3.2 非特异性RNase抑制剂 28

4.4 器皿和试剂的准备 29

4.4.1 二乙基焦碳酸酯 30

4.4.2 替代方法——用消毒水冲洗 31

4.4.3 过氧化氢 31

4.4.4 氢氧化钠和十二烷基硫酸钠 31

4.5 控制核酸酶活性的其他试剂 32

4.5.1 盐酸胍 32

4.5.2 硫氰酸胍 32

4.5.3 十二烷基硫酸钠 32

4.5.4 N-十二烷基肌氨酸钠 32

4.5.5 苯酚∶氯仿∶异戊醇 32

4.5.6 8-羟基喹啉 33

4.5.7 氯化铯 33

4.5.8 三氟乙酸铯 33

4.5.9 蛋白酶K 34

4.5.10 RNAlater（RNA保护剂） 34

4.6 实验方案：氧钒核糖核苷复合物的合成 34

4.7 参考文献 35

第5章 RNA分离策略 37

5.1 基本原理 37

5.2 RNA纯化的目的 38

5.3 裂解缓冲液的组成 40

5.3.1 温和的裂解缓冲液 40

5.3.2 离液裂解缓冲液 44

5.4 用含有胍离子的缓冲液分离RNA 45

5.5 胍-酸-酚抽提技术 46

5.5.1 实验方案：胍-酸-酚抽提 46

5.6 密度梯度离心 47

5.6.1 氯化铯 47

5.6.2 三氟乙酸铯 50

5.7 同时分离RNA和DNA 53

5.7.1 实验方案：同时分离RNA和DNA 53

5.8 试剂盒 55

5.8.1 硅胶技术 55

5.9 其他方法 56

5.9.1 实验方案：用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA 56

5.9.2 实验方案：原核RNA的分离 57

5.9.3 实验方案：酵母RNA的分离 58

5.10 纯化RNA的短期保存和长期保存 59

5.11 参考文献 60

第6章 从组织中提取RNA 62

6.1 基本原理 62

6.2 组织培养或组织 62

6.2.1 细胞培养的优点 63

6.2.2 组织样品的优点 63

6.3 匀浆方法 63

6.3.1 Polytron破碎 64

6.3.2 杜恩斯匀浆 64

6.4 从不同器官和组织分离RNA的方法 65

6.4.1 新鲜组织 65

6.4.2 冷冻组织 66

6.4.3 固定组织 67

6.5 实验方案：用氯化锂-尿素法从组织分离RNA 67

6.6 实验方案：从富含脂类的组织分离RNA 69

6.7 纯化嵌合在多核糖体的mRNA 70

6.7.1 实验方案：嵌入多核糖体的mRNA的提取 71

6.8 实地采集生物样品 72

6.9 RNA“净化”方法 73

6.10 参考文献 73

第7章 多聚腺苷酸RNA的分离 76

7.1 基本原理 76

7.2 多聚腺苷酸化 77

7.3 poly（A）的解释说明 77

7.4 多聚腺苷酸化mRNA的分离 79

7.5 用磁珠技术纯化poly(A)+RNA 80

7.5.1 实验方案：用磁珠纯化poly(A)+RNA 81

7.6 oligo（dT）纤维素柱层析 83

7.6.1 实验方案：生理量的poly(A)+RNA纯化 84

7.7 快速非柱式纯化poly(A)+RNA 87

7.7.1 实验方案：快速非柱式纯化poly(A)+RNA 87

7.8 参考文献 88

第8章 RNA制备的质量控制 90

8.1 基本原理 90

8.2 质量控制技术1：RNA的电泳检测 90

8.2.1 实验方案 92

8.3 质量控制技术2：紫外吸收光谱和吸收峰比值 92

8.3.1 核酸浓度和纯度的鉴定 93

8.4 质量控制技术3：RNA样品进行RT-PCR 96

8.5 质量控制技术4：Northern分析 96

8.6 质量控制技术5：RNA样品进行体外翻译 97

8.7 参考文献 97

第9章 斑点印迹分析 98

9.1 基本原理 98

9.2 斑点印迹的优点和缺点 99

9.3 合适的阴性对照和阳性对照 100

9.3.1 实验方案：RNA斑点印迹 100

9.3.2 实验方案：DNA斑点印迹 101

9.4 斑点印迹数据的局限性 102

9.5 参考文献 103

第10章 电泳 104

10.1 基本原理 104

10.2 核酸的标准化 104

10.2.1 实验方案：poly（A）的标准化 106

10.3 琼脂糖凝胶电泳中RNA样品变性方法 108

10.3.1 甲醛变性法 109

10.3.2 实验方案：甲醛变性胶 110

10.3.3 乙二醛／二甲基亚砜变性法 111

10.3.4 实验方案：乙二醛化与RNA电泳 112

10.4 分子量标准 113

10.4.1 分子量标准的正确使用 114

10.4.2 核糖体RNA 115

10.5 凝胶染色技术 119

10.5.1 溴化乙锭 119

10.5.2 SYBR绿 121

10.5.3 SYBR金 122

10.5.4 GelStar 122

10.5.5 银染 122

10.5.6 吖啶橙 123

10.5.7 亚甲基蓝 123

10.6 电泳过程中的安全问题 124

10.7 电泳仪器的维护 124

10.8 第一次进行琼脂糖凝胶电泳时的几点提示 125

10.8.1 基本术语 125

10.8.2 注意事项 125

10.9 参考文献 127

第11章 照片文档和图像分析 130

11.1 基本原理 130

11.2 照片文档 130

11.2.1 样本可视化 131

11.2.2 色彩过滤 132

11.2.3 安全第一 133

11.2.4 优化电泳图的一些小技巧 133

11.2.5 照相技术和X射线胶片固有的局限性 136

11.3 数字图像分析 136

11.3.1 图像格式 139

11.3.2 实践中需要考虑的问题 139

11.4 参考文献 141

第12章 Northern印迹分析 142

12.1 基本原理 142

12.2 滤膜的选取 142

12.2.1 硝酸纤维素膜 143

12.2.2 尼龙膜 143

12.2.3 聚偏二氟乙烯膜 144

12.3 膜的准备和取用 144

12.4 Northern转膜技术 145

12.4.1 毛细转膜法 145

12.4.2 涡轮印迹器 146

12.4.3 真空印迹法 146

12.4.4 正压转膜法 146

12.4.5 电转印迹法 146

12.4.6 碱印迹法 147

12.4.7 实验方案：用被动毛细扩散法转移RNA 147

12.4.8 实验方案：用涡轮印迹器向下转移RNA 149

12.5 转膜后膜的处理 150

12.5.1 甲醛变性系统 150

12.5.2 乙二醛变性系统 151

12.6 固定技术 151

12.6.1 烘烤 151

12.6.2 紫外线照射交联 151

12.6.3 实验方案：将RNA紫外交联于尼龙膜上 152

12.7 固定后膜的处理 152

12.8 参考文献 153

第13章 核酸探针技术 154

13.1 基本原理 154

13.2 探针的分类 155

13.3 标记系统的选择 155

13.3.1 同位素标记 156

13.3.2 非同位素标记 159

13.4 DNA探针 161

13.4.1 DNA探针的合成 162

13.5 反义RNA探针 164

13.5.1 RNA探针的特点 166

13.5.2 RNA探针的合成 166

13.6 探针的纯化 167

13.7 探针的保存 168

13.8 内源参照物 168

13.9 参考文献 170

第14章 核酸杂交应用 172

14.1 基本原理 172

14.2 影响杂交动力学和特异性的因素 172

14.2.1 温度 173

14.2.2 离子强度 173

14.2.3 pH 174

14.2.4 探针长度 174

14.2.5 探针浓度 174

14.2.6 （G+C）含量 174

14.2.7 错配 175

14.2.8 探针的复杂性 175

14.2.9 黏性 175

14.2.10 甲酰胺 176

14.3 杂交温度 176

14.3.1 长探针的Tm值计算 176

14.3.2 寡核苷酸探针的Tm值计算 176

14.4 杂交和Northern分析 177

14.4.1 预杂交：滤膜处理 177

14.4.2 实验方案：预杂交（长探针） 178

14.4.3 探针变性 178

14.4.4 杂交 179

14.4.5 杂交后严格洗涤 179

14.5 参考文献 179

第15章 检测原理 181

15.1 基本原理 181

15.2 放射自显影 182

15.2.1 滤膜的处理 183

15.2.2 X射线胶片 183

15.2.3 安全灯 184

15.2.4 曝光时间 185

15.2.5 增感屏 185

15.2.6 荧光成像法 186

15.2.7 胶片预闪 186

15.2.8 暗盒的规格 186

15.2.9 显影与定影 187

15.2.10 放射自显影：推荐方案 187

15.3 非同位素方法 188

15.3.1 生物素 189

15.3.2 地高辛 190

15.3.3 荧光标记的核苷酸 190

15.3.4 直接酶标法 191

15.3.5 化学发光检测法 191

15.3.6 显色检测法 193

15.4 数字成像系统 193

15.5 参考文献 194

第16章 核酸酶保护法定量测定特定的mRNA 196

16.1 基本原理 196

16.2 基本方法 198

16.3 探针选择 200

16.4 优化建议 202

16.5 可能的困难 203

16.6 实验方案：S1核酸酶保护分析法定量转录产物 204

16.7 实验方案：RNase保护分析法定量转录产物 206

16.8 参考文献 208

第17章 核RNA分析 210

17.1 基本原理 210

17.2 转录速率的检测 210

17.3 实验方案：核逃逸实验（新生mRNA分析技术） 213

17.3.1 细胞收集及细胞核的制备 213

17.3.2 用NP-40缓冲液裂解细胞 214

17.3.3 细胞核制备的备选方案：从组织培养的细胞中分离易损细胞核 214

17.3.4 细胞核制备的备选方案：从完整组织中分离细胞核 215

17.3.5 转录物的标记 216

17.3.6 标记转录物的回收 217

17.3.7 靶DNA的制备 218

17.3.8 用于杂交的RNA的制备 219

17.3.9 杂交后的洗脱和检测 220

17.4 实验方案：核逃逸实验（备选方法） 220

17.5 实验方案：核酸酶保护和脉冲标记转录法 222

17.6 RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ活性的区分 223

17.7 提取用于稳态分析的核RNA 224

17.8 实验方案：直接分离核RNA 225

17.9 实验方案：从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA 226

17.10 参考文献 227

第18章 cDNA合成 229

18.1 基本原理 229

18.2 cDNA合成概述 229

18.2.1 第一链合成的注意事项 231

18.2.2 第二链合成的注意事项 235

18.3 核定cDNA合成的效率 237

18.4 连接的注意事项 237

18.5 参考文献 238

第19章 反转录聚合酶链反应 239

19.1 基本原理 239

19.2 聚合酶链反应概述 239

19.3 反转录聚合酶链反应基本方法 243

19.4 实验室设计 246

19.5 引物设计 246

19.5.1 基本标准 250

19.5.2 Tm值 251

19.6 优化程序 252

19.7 PCR产物的分析 256

19.8 RT-PCR质量监控点 256

19.9 相关技术 258

19.9.1 cDNA 5′末端快速扩增PCR 258

19.9.2 cDNA 3′末端快速扩增PCR 260

19.9.3 巢式PCR 261

19.10 实验方案：cDNA第一链的合成 261

19.11 实验方案：PCR反应扩增cDNA 262

19.12 PCR产物的克隆 263

19.13 实验方案：平末端PCR产物的末端加A 264

19.14 实验方案：TA克隆的连接反应 264

19.15 TOPO克隆 266

19.16 参考文献 266

第20章 定量PCR技术 268

20.1 基本原理 268

20.2 灵敏度指标 268

20.3 定量方法 269

20.4 内源参照物 270

20.5 外源参照物 272

20.6 对照反应的规划 273

20.7 关于负对照 276

20.8 竞争PCR的关键因素 276

20.9 竞争PCR的主要步骤 280

20.10 实验方案：竞争PCR 281

20.10.1 非同源竞争模板的合成 282

20.10.2 第一链cDNA的合成 283

20.10.3 竞争PCR（初级扩增） 283

20.10.4 竞争PCR（次级扩增） 285

20.11 关于图像分析的考虑 286

20.12 竞争PCR的问题解答 287

20.13 实时PCR 289

20.14 参考文献 292

第21章 转录差减法 296

21.1 基本原理 296

21.2 关键问题 297

21.3 差减-校正PCR 298

21.4 非PCR差减 302

21.5 差减法的问题与解决办法 303

21.6 参考文献 305

第22章 mRNA差异显示 307

22.1 基本原理 307

22.2 一般过程 307

22.3 物的多样性：预期得到什么 314

22.4 实验方案：mRNA差异显示 316

22.4.1 cDNA的合成 316

22.4.2 通过PCR扩增cDNA的各个组分 316

22.4.3 PCR产物分析 317

22.5 实验方案：差异表达序列的鉴定和筛选 319

22.6 用亲和俘获回收差异表达的序列 320

22.7 PCR产物的克隆 320

22.8 差异表达的验证 321

22.9 进一步的鉴定 321

22.10 差异显示的应用 322

22.11 mRNA差异显示的问题与解决方法 322

22.12 参考文献 324

第23章 基因表达的高通量分析 326

23.1 基本原理 326

23.2 微阵列是什么 326

23.3 微阵列能做什么 327

23.4 微阵列不能做什么 329

23.5 微阵列分析的主要步骤 329

23.6 参比RNA 331

23.7 应用 331

23.8 参考文献 332

第24章 RNA干扰——目标基因的沉默 333

24.1 基本原理 333

24.2 重要的RNAi术语 334

24.3 RNAi是如何工作的 335

24.3.1 siRNA的导入途径 336

24.3.2 shRNA的导入方法 337

24.3.3 DNA指导的RNAi技术 338

24.3.4 siRNA导入哺乳动物细胞的技术 339

24.4 有效的siRNA设计 339

24.5 体外和体内的问题 340

24.6 参考文献 342

第25章 基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学 345

25.1 基本原理 345

25.2 重要术语 346

25.3 基因组与基因组学 346

25.4 转录组与转录组学 347

25.5 蛋白质组与蛋白质组学 348

25.6 生物信息学 349

25.7 参考文献 351

第26章 一个RNA范例 352

26.1 典型实验 353

26.2 灵敏度的问题 355

26.3 有待进行的 355

26.4 到哪儿去寻求帮助 357

尾声 358

智慧的结晶 358

附录 362

附录1 保存完整和准确的记录 362

附录2 储存液 363

附录3 苯酚的制备 367

附录4 溴化乙锭和SYBR绿溶液的处置 369

附录5 用DNaseⅠ去除RNA样品中的DNA 371

附录6 用RNase去除DNA样品中的RNA 372

附录7 甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子化 373

附录8 硅烷化离心管和玻璃器皿 373

附录9 分子生物学家的主流工具——离心法 373

附录10 胰蛋白酶消化贴壁细胞的方法 377

附录11 用盐析法分离高分子量DNA 378

附录12 从植物组织中分离RNA 380

附录13 电泳——原理、参数和安全 380

附录14 聚丙烯酰胺凝胶电泳 388

附录15 仪器、试剂和服务的供应商 389

附录16 SI词头 393

附录17 通用缩写 393

附录18 商标引用 394

术语表 397

索引 409