1 引言 1
1.1 植物开花机理的研究进展 3
1.1.1 植物花芽分化过程的调节机制 4
1.1.2 环境条件对植物成花的调控 6
1.2 大豆光周期现象的研究进展 19
1.2.1 大豆生育期性状的光周期反应特性 19
1.2.2 光周期对大豆农艺性状和籽粒品质的影响 22
1.2.3 大豆中光敏感性E等位基因的研究进展 23
1.2.4 大豆开花时间基因图谱的绘制 24
1.3 拟南芥开花诱导的分子生物学研究进展 27
1.3.1 周期途径 28
1.3.2 春化促进途径 33
1.3.3 自主途径 34
1.3.4 赤霉素途径 35
1.3.5 染色质结构和开花抑制 36
1.3.6 拟南芥开花途径的整合 37
1.3.7 植物中的拟南芥开花途径的基因保守性 39
1.4 植物衰老的研究 44
1.4.1 衰老的生理生化反应特性 44
1.4.2 衰老学说 46
1.4.3 衰老的调控 49
1.5 RAV转录因子的研究进展 52
1.6 基因差异表达的研究方法 53
1.6.1 基于cDNA的PCR扩增方法 54
1.6.2 基于差减杂交的克隆方法 56
1.6.3 表达序列标签 61
1.6.4 基因表达系列分析 61
1.6.5 微阵列杂交 62
1.6.6 实时荧光定量PCR技术 64
1.7 植物遗传转化 65
1.7.1 植物遗传转化方法 65
1.8 研究目的和意义 69
2 材料和方法 73
2.1 实验材料和试剂 75
2.1.1 植物材料 75
2.1.2 菌种及载体 75
2.1.3 主要试剂 75
2.2 实验方法 76
2.2.1 抑制性消减杂交（SSH） 76
2.2.2 抑制消减文库的构建 84
2.2.3 反向Northern blot斑点杂交筛选消减文库 87
2.2.4 测序及序列同源性检索 89
2.2.5 实时荧光定量PCR进一步验证差异表达的片段 90
2.2.6 RACE方法克隆大豆GmRAV基因 92
2.2.7 Real-time RT-PCR分析GmRAV的表达 96
2.2.8 植物表达载体pBl121-GmRAV的构建 97
2.2.9 农杆菌介导法转化烟草叶盘 101
2.2.10 转基因烟草的分子生物学检测 103
2.2.11 转GmRAV基因烟草T2代功能分析 106
3 结果与分析 109
3.1 抑制性消减杂交（SSH） 111
3.1.1 大豆总RNA的提取 111
3.1.2 SMART技术合成cDNA 111
3.1.3 双链cDNA的Rsal酶切结果 112
3.1.4 正向差减产物的PCR扩增结果 113
3.1.5 反向Northern斑点杂交筛选结果 114
3.1.6 测序与同源性检索结果 116
3.1.7 候选cDNA片段差异表达检测分析结果 116
3.1.8 基因功能相关分析 117
3.2 大豆GmRAV基因克隆 122
3.2.1 大豆GmRAV基因5'RACE和3'RACE克隆 122
3.2.2 大豆GmRAV基因全长序列的生物信息学及系统进化分析 123
3.2.3 GmRAV全长基因组DNA序列的获得 127
3.3 大豆GmRAV基因表达研究 128
3.3.1 大豆叶片中GmRAV基因在LD和SD条件下基因表达 128
3.3.2 大豆GmRAV基因在LD和SD条件下组织特异性表达分析 128
3.3.3 激素对大豆叶片中GmRAV基因的表达影响 130
3.4 植物表达载体pBI121-GmRAV的构建 130
3.5 烟草的遗传转化 133
3.5.1 丛生芽和根的诱导 133
3.5.2 转基因烟草的PCR检测 133
3.5.3 转基因烟草的PCR-Southern检测 134
3.5.4 转基因烟草的Northern blot检测 136
3.5.5 长日照和短日照下转基因烟草的T2代表型观察 136
3.5.6 转GmRAV基因烟草植株矮化与BR和GA激素有关 137
3.5.7 过量表达GmRAV增强了ABA促进叶片衰老的效应 139
3.5.8 暗处理下GmRAV过量表达加速植株的衰老 140
4 讨论 141
4.1 光周期和衰老相关基因表达谱分析 143
4.2 光周期和衰老相关基因的克隆 146
4.3 植物表达载体的构建及烟草的遗传转化 148
4.3.1 采用农杆菌转化植物的优势 149
4.3.2 转化农杆菌及其鉴定 149
4.3.3 用于转化的农杆菌的培养 149
4.3.4 叶盘法转化烟草 150
5 结论 153
参考文献 158
附录 176
攻读学位期间发表的学术论文 180
图版 181