1真核基因转录调控的基础知识 1
引言 1
基因调控的基本模型 2
概念和策略：Ⅰ．启动子和基本转录机构 5
前言 7
目 录 7
核心启动子结构 8
绪言 9
基本转录机构 10
TAFⅡ 12
缩略词 13
全酶和中介体 14
概念和策略：Ⅱ．激活因子和抑制因子 20
调控性启动子和增强子 20
转录激活因子 21
抑制因子和共抑制因子 25
概念和策略：Ⅲ．染色质和基因调控 26
染色质 26
ATP依赖型重建复合体 29
染色质的乙酰化 32
组蛋白去乙酰化、转录抑制和转录沉默 34
基因座控制区、绝缘子和基质附着区 37
联合调控、协同性和协同作用 40
概念和策略：Ⅳ．增强体 40
增强体理论 41
IFN-β增强体 42
激活作用的生化机制 43
展望 44
2初始策略 53
引言 53
概念和策略 54
基因调控分析的首要步骤 54
达到特定目标所需投入的时间和资源 56
论证分析的可行性 59
进行转录调控分析 62
总结 63
3 mRNA丰度的调控模式 65
引言 65
概念和策略 66
转录起始与mRNA稳定性 66
转录延伸 78
前体mRNA差异剪接、mRNA的转运和多聚腺苷酸化 85
技术 87
方案3.1核连缀转录分析 87
4转录起始位点的定位 96
引言 96
初始阶段需要考虑的问题 98
概念和策略 98
引物延伸 99
RNase保护 104
S1核酸酶分析 107
cDNA末端的快速扩增 111
技术 115
方案4.1引物延伸分析 115
方案4.2 RNase保护分析 121
方案4.3 S1核酸酶分析 127
5启动子的功能性分析方法 133
引言 134
分析方法的选择：各种分析方法的优缺点 139
概念和策略 139
瞬时转染分析 143
通过染色体整合的稳定转染分析 159
技术 167
哺乳动物细胞的常用转染方法 167
方案5.1 3T3成纤维细胞的磷酸钙转染 168
方案5.2淋巴细胞系的DEAE－葡聚糖转染 170
方案5.3 RAW264.7巨噬细胞的电穿孔转染 172
常用的报道酶分析法 174
方案5.4荧光素酶分析 174
方案5.5氯霉素乙酰转移酶分析 176
方案5.6β－半乳糖苷酶分析 178
6远距离调控区的鉴定和分析 184
引言 184
概念和策略 186
DNaseⅠ超敏感性分析 186
基质附着区的鉴定 191
远距离调控区的功能性分析法 192
用于表征远距离调控区的功能性分析法 196
7鉴定调控区中的顺式作用DNA元件 204
引言 204
通过综合性突变分析鉴定调控元件 206
概念和策略 206
利用体内或体外蛋白质－DNA相互作用鉴定调控元件 227
通过数据库分析鉴定调控元件 228
诱变技术 229
8 DNA结合蛋白的鉴定及其基因的分离 242
引言 242
鉴定DNA结合蛋白的概念和策略 244
数据库检索法 244
粗制细胞裂解物的蛋白质－DNA相互作用分析方法的建立 245
克隆编码DNA结合蛋白基因的概念和策略 265
通过蛋白质纯化法和肽序列分析法进行克隆 268
通过不需要进行蛋白质－DNA相互作用分析的方法进行克隆 276
引言 284
9确证蛋白质－DNA相互作用的功能相关性 284
概念和策略 286
体外蛋白质－DNA复合体的丰度 286
DNA结合蛋白和靶基因的相对表达模式 288
蛋白质结合所需核苷酸和调控元件活性所需核苷酸的相关性 289
DNA结合蛋白的过量表达对报道基因或内源基因的反式激活 290
与相邻调控区相结合的蛋白质间协同结合和协同效应 292
基因组足迹模式和体外足迹模式的比较 294
蛋白质－DNA相互作用的相对亲和力 295
基因剔除或反义实验 297
显性失活突变体 298
体外转录方法 301
体内蛋白质－DNA交联 303
改变特异性的实验 306
10内源调控区的体内分析 311
引言 311
概念和策略 313
序列特异性蛋白质－DNA相互作用的体内分析 313
核小体的定位和重建 318
DNA甲基化 328
基因的亚核定位 328
技术 329
方案10.1 MNase-Southern印迹分析法 329
方案10.2 LM-PCR方法 337
引言 355
11合成重组转录因子的方法 355
概念和策略 357
原核表达体系 357
克服E.coli中表达问题的策略 365
合成大的调控蛋白 367
合成小量的粗制蛋白质 378
大分子复合体的合成与纯化 381
适当表达体系的选择 383
12鉴定和分析转录因子结构域 389
引言 389
诱变的基本原理 390
概念和策略：定义结构域 390
基因激活因子的结构域 392
分离激活因子的DNA结合结构域和激活结构域 393
DNA识别亚结构域和寡聚化亚结构域的划分 399
概念和策略：蛋白质－蛋白质相互作用 402
激活结构域和共激活因子及通用因子的相互作用 402
亲和层析 403
改变特异性的遗传体系 407
基本转录机构的结构－功能分析 409
技术 413
方案12.1 PCR介导的定点诱变 413
引言 423
13调节性转录因子结合DNA的理论、特征和模型 423
概念和策略 426
DNA－蛋白质相互作用的基本理论和实例 426
DNA－蛋白质相互作用的分析和模型 439
启动子特异性多组分核蛋白复合体的分析 456
技术 463
方案13.1 DNaseⅠ足迹法 463
方案13.2羟自由基足迹法 473
方案13.3磷酸乙基化干扰分析 476
方案13.4甲基化干扰分析 479
方案13.5电泳迁移率变动分析 483
方案13.6制备32p末端标记的DNA片段 487
14用于体外转录分析的粗制系统和分级分离系统 496
引言 497
概念和策略 498
抽提物的制备 498
转录分析 501
分级分离系统 510
技术 518
核抽提物和全细胞抽提物的制备 518
方案14.1Dignam和Roeder法制备核抽提物 519
方案14.2从大鼠肝中制备核抽提物 523
方案14.3制备全细胞抽提物 528
转录 530
体外转录分析 530
方案14.4利用HeLa细胞抽提物和引物延伸法进行体外 530
方案14.5利用HeLa细胞核抽提物进行无G序列盒体外 536
转录 536
转录因子的纯化 539
方案14.6粗制分级分离系统的制备 541
方案14.7重组TFIIB从E.coli中的纯化 546
方案14.8重组TFIIA的纯化 550
方案14.9RNA PolⅡ的亲和纯化 552
方案14.10已附加表位的TFIID的纯化 556
引言 567
15研究转录复合体组装的方法 567
概念和策略 569
基本前起始复合体的形成 569
开放复合体的形成、起始和启动子撤离 576
活化的复合体在启动子处的组装 583
技术 592
方案15.1 PolⅡ开放复合体的高锰酸钾探测 592
方案15.2与DNA相结合的TFIID的镁－琼脂糖EMSA 596
附录 605
附录1注意事项 605
附录2供应商 610
附录3商标 611