真核生物转录调控 概念、策略与方法PDF电子书下载

1真核基因转录调控的基础知识 1

引言 1

基因调控的基本模型 2

概念和策略：Ⅰ．启动子和基本转录机构 5

前言 7

目 录 7

核心启动子结构 8

绪言 9

基本转录机构 10

TAFⅡ 12

缩略词 13

全酶和中介体 14

概念和策略：Ⅱ．激活因子和抑制因子 20

调控性启动子和增强子 20

转录激活因子 21

抑制因子和共抑制因子 25

概念和策略：Ⅲ．染色质和基因调控 26

染色质 26

ATP依赖型重建复合体 29

染色质的乙酰化 32

组蛋白去乙酰化、转录抑制和转录沉默 34

基因座控制区、绝缘子和基质附着区 37

联合调控、协同性和协同作用 40

概念和策略：Ⅳ．增强体 40

增强体理论 41

IFN-β增强体 42

激活作用的生化机制 43

展望 44

2初始策略 53

引言 53

概念和策略 54

基因调控分析的首要步骤 54

达到特定目标所需投入的时间和资源 56

论证分析的可行性 59

进行转录调控分析 62

总结 63

3 mRNA丰度的调控模式 65

引言 65

概念和策略 66

转录起始与mRNA稳定性 66

转录延伸 78

前体mRNA差异剪接、mRNA的转运和多聚腺苷酸化 85

技术 87

方案3.1核连缀转录分析 87

4转录起始位点的定位 96

引言 96

初始阶段需要考虑的问题 98

概念和策略 98

引物延伸 99

RNase保护 104

S1核酸酶分析 107

cDNA末端的快速扩增 111

技术 115

方案4.1引物延伸分析 115

方案4.2 RNase保护分析 121

方案4.3 S1核酸酶分析 127

5启动子的功能性分析方法 133

引言 134

分析方法的选择：各种分析方法的优缺点 139

概念和策略 139

瞬时转染分析 143

通过染色体整合的稳定转染分析 159

技术 167

哺乳动物细胞的常用转染方法 167

方案5.1 3T3成纤维细胞的磷酸钙转染 168

方案5.2淋巴细胞系的DEAE－葡聚糖转染 170

方案5.3 RAW264.7巨噬细胞的电穿孔转染 172

常用的报道酶分析法 174

方案5.4荧光素酶分析 174

方案5.5氯霉素乙酰转移酶分析 176

方案5.6β－半乳糖苷酶分析 178

6远距离调控区的鉴定和分析 184

引言 184

概念和策略 186

DNaseⅠ超敏感性分析 186

基质附着区的鉴定 191

远距离调控区的功能性分析法 192

用于表征远距离调控区的功能性分析法 196

7鉴定调控区中的顺式作用DNA元件 204

引言 204

通过综合性突变分析鉴定调控元件 206

概念和策略 206

利用体内或体外蛋白质－DNA相互作用鉴定调控元件 227

通过数据库分析鉴定调控元件 228

诱变技术 229

8 DNA结合蛋白的鉴定及其基因的分离 242

引言 242

鉴定DNA结合蛋白的概念和策略 244

数据库检索法 244

粗制细胞裂解物的蛋白质－DNA相互作用分析方法的建立 245

克隆编码DNA结合蛋白基因的概念和策略 265

通过蛋白质纯化法和肽序列分析法进行克隆 268

通过不需要进行蛋白质－DNA相互作用分析的方法进行克隆 276

引言 284

9确证蛋白质－DNA相互作用的功能相关性 284

概念和策略 286

体外蛋白质－DNA复合体的丰度 286

DNA结合蛋白和靶基因的相对表达模式 288

蛋白质结合所需核苷酸和调控元件活性所需核苷酸的相关性 289

DNA结合蛋白的过量表达对报道基因或内源基因的反式激活 290

与相邻调控区相结合的蛋白质间协同结合和协同效应 292

基因组足迹模式和体外足迹模式的比较 294

蛋白质－DNA相互作用的相对亲和力 295

基因剔除或反义实验 297

显性失活突变体 298

体外转录方法 301

体内蛋白质－DNA交联 303

改变特异性的实验 306

10内源调控区的体内分析 311

引言 311

概念和策略 313

序列特异性蛋白质－DNA相互作用的体内分析 313

核小体的定位和重建 318

DNA甲基化 328

基因的亚核定位 328

技术 329

方案10.1 MNase-Southern印迹分析法 329

方案10.2 LM-PCR方法 337

引言 355

11合成重组转录因子的方法 355

概念和策略 357

原核表达体系 357

克服E.coli中表达问题的策略 365

合成大的调控蛋白 367

合成小量的粗制蛋白质 378

大分子复合体的合成与纯化 381

适当表达体系的选择 383

12鉴定和分析转录因子结构域 389

引言 389

诱变的基本原理 390

概念和策略：定义结构域 390

基因激活因子的结构域 392

分离激活因子的DNA结合结构域和激活结构域 393

DNA识别亚结构域和寡聚化亚结构域的划分 399

概念和策略：蛋白质－蛋白质相互作用 402

激活结构域和共激活因子及通用因子的相互作用 402

亲和层析 403

改变特异性的遗传体系 407

基本转录机构的结构－功能分析 409

技术 413

方案12.1 PCR介导的定点诱变 413

引言 423

13调节性转录因子结合DNA的理论、特征和模型 423

概念和策略 426

DNA－蛋白质相互作用的基本理论和实例 426

DNA－蛋白质相互作用的分析和模型 439

启动子特异性多组分核蛋白复合体的分析 456

技术 463

方案13.1 DNaseⅠ足迹法 463

方案13.2羟自由基足迹法 473

方案13.3磷酸乙基化干扰分析 476

方案13.4甲基化干扰分析 479

方案13.5电泳迁移率变动分析 483

方案13.6制备32p末端标记的DNA片段 487

14用于体外转录分析的粗制系统和分级分离系统 496

引言 497

概念和策略 498

抽提物的制备 498

转录分析 501

分级分离系统 510

技术 518

核抽提物和全细胞抽提物的制备 518

方案14.1Dignam和Roeder法制备核抽提物 519

方案14.2从大鼠肝中制备核抽提物 523

方案14.3制备全细胞抽提物 528

转录 530

体外转录分析 530

方案14.4利用HeLa细胞抽提物和引物延伸法进行体外 530

方案14.5利用HeLa细胞核抽提物进行无G序列盒体外 536

转录 536

转录因子的纯化 539

方案14.6粗制分级分离系统的制备 541

方案14.7重组TFIIB从E.coli中的纯化 546

方案14.8重组TFIIA的纯化 550

方案14.9RNA PolⅡ的亲和纯化 552

方案14.10已附加表位的TFIID的纯化 556

引言 567

15研究转录复合体组装的方法 567

概念和策略 569

基本前起始复合体的形成 569

开放复合体的形成、起始和启动子撤离 576

活化的复合体在启动子处的组装 583

技术 592

方案15.1 PolⅡ开放复合体的高锰酸钾探测 592

方案15.2与DNA相结合的TFIID的镁－琼脂糖EMSA 596

附录 605

附录1注意事项 605

附录2供应商 610

附录3商标 611