第1章 实验前后的注意事项和行为准则 1
1.1 实验过程中的注意事项 1
1.1.1 实验前的注意事项 1
1.1.2 实验中的注意事项 4
1.1.3 实验后的注意事项 6
1.2 实验室成员的基本素质与行为准则 9
1.3 实验中的一些技巧及心得 14
1.3.1 提取高质量的RNA的技巧 14
1.3.2 细胞冻存及复苏 16
1.3.3 稳定转染后的检测方法 17
1.3.4 连接转化实验心得 17
1.3.5 Western Blot 19
参考文献 21
第一部分 DNA相关的操作 24
第2章 质粒DNA的相关实验 24
2.1 质粒DNA的分离与纯化 24
2.1.1 概述 24
2.1.2 实验材料、仪器和试剂 26
2.1.3 实验原理、操作步骤和实验要点 27
2.2 DNA酶切与电泳分析 32
2.2.1 概述 32
2.2.2 实验材料、仪器和试剂 34
2.2.3 实验原理、操作步骤和实验要点 34
2.3 重组质粒的连接、转化及筛选 37
2.3.1 概述 37
2.3.2 实验材料、仪器和试剂 40
2.3.3 实验原理、操作步骤和实验要点 41
参考文献 45
第3章 聚合酶链式反应 47
3.1 标准PCR反应和扩增产物克隆 47
3.1.1 概述 47
3.1.2 实验材料、仪器和试剂 52
3.1.3 实验原理、操作步骤和实验要点 52
3.2 反转录PCR(RT-PCR) 57
3.2.1 概述 57
3.2.2 实验材料、仪器和试剂 58
3.2.3 实验原理、操作步骤和实验要点 58
3.3 出错PCR（致突变PCR） 63
3.3.1 概述 63
3.3.2 实验材料、仪器和试剂 64
3.3.3 实验原理、操作步骤和实验要点 65
3.4 基于重叠延伸PCR的DNA合成技术 70
3.4.1 概述 70
3.4.2 实验材料、仪器和试剂 71
3.4.3 实验原理、操作步骤和实验要点 72
参考文献 74
第4章 限制性内切酶的特性及应用 77
4.1 概述 77
4.2 实验方案 77
4.2.1 单限制性内切酶对单DNA样品的消化 77
4.2.2 消化多个DNA样品 78
4.2.3 多限制性内切酶消化DNA样品 78
4.2.4 限制性内切酶对DNA的部分消化 78
4.2.5 DNA的甲基化 79
4.3 相关知识 80
4.3.1 背景知识 80
4.3.2 关键因素 81
4.3.3 时间安排 83
4.3.4 预期结果 83
参考文献 83
第5章 基因组DNA的提取 85
5.1 动物组织基因组DNA的提取 85
5.1.1 概述 85
5.1.2 实验材料 85
5.1.3 实验步骤 85
5.1.4 关键因素 86
5.1.5 常见问题 86
5.1.6 所需时间 86
5.1.7 本节溶液配制 87
5.2 植物组织基因组DNA的提取 87
5.2.1 基本方案——氯化铯离心法 87
5.2.2 备选方案——CTAB法 88
5.3 人白细胞DNA的提取 90
5.3.1 概述 90
5.3.2 实验材料 90
5.3.3 实验步骤 90
5.3.4 关键因素 91
5.3.5 所需时间 91
5.4 DNA琼脂糖凝胶电泳及回收 91
5.4.1 琼脂糖凝胶分离DNA 91
5.4.2 基本方案1——DNA电洗脱 92
5.4.3 基本方案2——NA-45纸电泳法 93
5.4.4 基本方案3——用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段 94
5.4.5 备选方案1——使用β-琼脂糖酶从低熔点琼脂糖中回收DNA 94
5.4.6 备选方案2——用玻璃珠法从低熔点琼脂糖中回收DNA 95
5.4.7 本节溶液配制 95
5.5 非变性聚丙烯酰胺胶电泳及DNA回收 96
5.5.1 基本方案 96
5.5.2 备选方案——通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段 98
参考文献 98
第6章 分子探针及Southern杂交 100
6.1 探针的种类及其选择 100
6.1.1 探针的概念 100
6.1.2 探针的种类及其选择 100
6.2 探针标记物的种类及其选择 104
6.2.1 核素标记物 104
6.2.2 非放射性标记物 104
6.3 探针标记方法及其选择 105
6.3.1 双链DNA探针标记方法 105
6.3.2 单链DNA探针标记方法 109
6.3.3 末端标记DNA探针 112
6.3.4 寡核苷酸探针标记方法 112
6.3.5 RNA探针 114
6.4 探针的纯化 114
6.4.1 乙醇沉淀法 114
6.4.2 Sephadex G-50柱层析法 115
6.4.3 微柱离心法 115
6.5 Southern杂交 115
6.5.1 实验原理 115
6.5.2 基因组Southern Blot步骤 116
6.5.3 背景信息 121
6.5.4 关键参数 121
6.5.5 问题解决方法 122
6.5.6 预期结果 122
6.5.7 时间控制 122
6.5.8 优化方案 123
参考文献 126
第7章 基因组DNA的突变分析 128
7.1 概述 128
7.2 实验方案 128
7.2.1 PCR产物单链构象多态分析（PCR-single-strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP） 129
7.2.2 PCR-异源双链构象分析法（PCR-heteroduplex Analysis,PCR-HA） 130
7.2.3 PCR产物直接测序 130
7.2.4 PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP） 132
7.3 相关知识 133
7.3.1 背景知识 133
7.3.2 关键因素 135
7.3.3 时间安排 138
7.3.4 预期结果 139
参考文献 139
第二部分 RNA相关的操作 142
第8章 RNA的提取和cDNA合成 142
8.1 概述 142
8.2 组织或细胞的总RNA提取 143
8.2.1 细胞或者组织样品匀浆处理 143
8.2.2 RNA的抽提 143
8.2.3 RNA定量 144
8.2.4 RNA凝胶电泳 144
8.2.5 保温实验 144
8.2.6 材料与试剂 144
8.2.7 相关知识 145
8.3 mRNA的分离与纯化 146
8.3.1 装柱与平衡柱子 146
8.3.2 柱上吸附poly(A+)RNA 146
8.3.3 从柱中洗脱poly(A+)RNA 146
8.3.4 Oligo(dT)-纤维素再生 146
8.3.5 材料与试剂 147
8.3.6 相关知识 147
8.4 cDNA的合成 147
8.4.1 cDNA第一链的合成 147
8.4.2 cDNA第二链的合成 148
8.4.3 cDNA合成产物定量分析 149
8.4.4 cDNA合成产物电泳分析 150
8.4.5 材料与试剂 150
8.4.6 相关知识 150
参考文献 151
第9章 寻找差异表达基因方法——SSH法 154
9.1 概述 154
9.2 实验方案 155
9.2.1 RNA提取和cDNA合成 155
9.2.2 Rsa I酶切消化 155
9.2.3 寡聚核苷酸接头（Adaptor）连接 156
9.2.4 第一次消减杂交 157
9.2.5 第二次消减杂交 157
9.2.6 PCR扩增 158
9.2.7 克隆消减cDNA文库 159
9.3 材料与试剂 160
9.3.1 试剂 160
9.3.2 仪器设备 161
9.4 相关知识 161
9.4.1 背景知识 161
9.4.2 关键因素 162
9.4.3 时间安排 162
9.4.4 预期结果 162
参考文献 163
第10章 全长基因的克隆——SMART技术 165
10.1 概述 165
10.2 实验方案 166
10.2.1 第一链cDNA合成 166
10.2.2 LD PCR扩增cDNA 167
10.2.3 蛋白酶K的消化 167
10.2.4 Sfi I酶切消化 168
10.2.5 通过CHROMA SPIN-400使cDNA链分段 168
10.2.6 连接cDNA到载体中 169
10.2.7 细菌的培养 170
10.2.8 滴定未扩增的文库 170
10.2.9 测定重组率 170
10.2.10 文库扩增 171
10.2.11 滴定扩增文库 171
10.3 材料与试剂 172
10.3.1 试剂 172
10.3.2 仪器设备 172
10.4 相关知识 173
10.4.1 背景知识 173
10.4.2 关键因素 173
10.4.3 时间安排 174
10.4.4 预期结果 174
参考文献 174
第11章 Northern Blot技术 176
11.1 概述 176
11.2 实验方案 176
11.2.1 经甲醛变性处理后进行的RNA电泳 176
11.2.2 变性RNA在膜上的转移和固定 177
11.2.3 探针标记 178
11.2.4 杂交和放射自显影 178
11.3 材料与试剂 179
11.3.1 试剂 179
11.3.2 仪器设备 179
11.4 相关知识 179
11.4.1 背景知识 179
11.4.2 关键因素 180
11.4.3 时间安排 180
11.4.4 预期结果 180
参考文献 180
第12章 siRNA的应用 182
12.1 概述 182
12.2 实验方案 183
12.2.1 siRNA设计 183
12.2.2 转录模板制备 184
12.2.3 dsRNA合成 184
12.2.4 siRNA制备和纯化 184
12.3 材料与试剂 185
12.3.1 试剂 185
12.3.2 仪器设备 185
12.4 相关知识 185
12.4.1 背景知识 185
12.4.2 关键因素 186
12.4.3 时间安排 186
12.4.4 预期结果 186
参考文献 186
第13章 RNA酶保护实验 188
13.1 概述 188
13.2 实验方案 188
13.2.1 制备标记的单链反义RNA探针 188
13.2.2 RNA杂交 189
13.2.3 RNA酶消化 189
13.2.4 凝胶电泳和放射自显影 189
13.3 材料与试剂 190
13.3.1 试剂 190
13.3.2 仪器设备 190
13.4 相关知识 190
13.4.1 背景知识 190
13.4.2 关键因素 191
13.4.3 时间安排 191
13.4.4 预期结果 191
参考文献 192
第三部分 蛋白质相关的操作 196
第14章 蛋白质分离、鉴定相关技术 196
14.1 蛋白的双向电泳 196
14.1.1 样品的准备 196
14.1.2 电泳 199
14.1.3 蛋白的检测 203
14.1.4 问题解决及关键因素 205
14.1.5 时间花费 207
14.1.6 背景信息 208
14.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 208
14.2.1 实验原理 208
14.2.2 材料与试剂 210
14.2.3 背景知识 211
14.2.4 影响因素 211
14.2.5 问题解决 212
14.2.6 时间安排 213
14.2.7 预期结果 213
14.3 Western印迹法 214
14.3.1 实验原理 214
14.3.2 材料、试剂和仪器 215
14.3.3 试剂的配制方法 215
14.3.4 方法与步骤 217
14.3.5 背景信息 221
14.3.6 问题解决 221
14.3.7 关键因素 222
14.3.8 时间花费 224
参考文献 224
第15章 染色质免疫沉淀技术（ChIP） 229
15.1 概述 229
15.2 实验方案 231
15.2.1 甲醛交联细胞 231
15.2.2 染色质超声断裂 231
15.2.3 免疫沉淀蛋白和DNA复合物 231
15.2.4 收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA） 232
15.2.5 洗脱免疫复合物 232
15.2.6 去除甲醛交联 232
15.2.7 DNA纯化 232
15.2.8 染色质免疫沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定 233
15.3 材料试剂 233
15.3.1 试剂 233
15.3.2 仪器设备 234
15.4 相关知识 234
15.4.1 背景知识 234
15.4.2 关键因素 235
15.4.3 时间安排 235
15.4.4 预期结果 235
参考文献 235
第16章 蛋白复合体的分离与鉴定 238
16.1 Yoshihiro Nakatani的研究方法（Sasaki,Mello et al.,2009） 239
16.1.1 稳定表达目的蛋白的载体系统 239
16.1.2 逆转录病毒载体转染包装细胞 240
16.1.3 逆转录病毒的转导 241
16.1.4 转导阳性细胞的分选 242
16.1.5 带有表位标签外源蛋白表达的检测 243
16.1.6 细胞的大规模培养 244
16.1.7 细胞不同组分的分离 245
16.2 分离蛋白复合体的具体操作 247
16.2.1 MAML1内源性蛋白复合体的分离 247
16.2.2 免疫亲和纯化MAML1蛋白复合体的实验操作 250
16.2.3 其他蛋白复合体的实验操作 255
16.2.4 后续实验操作的具体实验方案 260
参考文献 262
第17章 免疫沉淀 266
17.1 实验原理 266
17.2 仪器、材料和试剂 267
17.2.1 裂解缓冲液 267
17.2.2 其他试剂 267
17.2.3 仪器和材料 268
17.3 方法与步骤 268
17.3.1 裂解产物的准备 268
17.3.2 裂解液的预处理 269
17.3.3 免疫沉淀 269
17.4 背景知识 270
17.5 关键参数 270
17.5.1 抗原的提取 270
17.5.2 抗体的产量 270
17.5.3 多抗单抗的选择 271
17.5.4 抗体滴度 271
17.5.5 免疫吸附剂 271
17.5.6 非特异性对照的设立 271
17.5.7 洗涤 271
17.6 问题解决 272
17.6.1 非特异性条带 272
17.6.2 分离胶高背景 272
17.6.3 轻链重链显示 272
17.7 预期结果 272
17.8 时间花费 272
17.9 注意事项 273
17.9.1 抗体的性质 273
17.9.2 缓冲液的性质 273
17.9.3 防止蛋白变化 273
17.9.4 抗体／缓冲液的比例 273
17.10 抗体与Beads配对表 273
参考文献 274
第18章 免疫荧光染色技术 276
18.1 概述 276
18.2 实验原理 276
18.3 仪器、材料和试剂 276
18.4 方法与步骤 277
18.4.1 制片 277
18.4.2 固定 277
18.4.3 水洗 277
18.4.4 染色 278
18.5 预期结果 278
18.6 背景知识 278
18.7 关键参数 279
18.8 问题解决 279
18.9 时间花费 279
18.10 标本保存 280
18.11 注意事项 280
18.12 非特异性染色的消除方法 280
18.12.1 主要原因 280
18.12.2 消除方法 280
18.13 常用固定方法与试剂 283
参考文献 283
第四部分 细胞生物学相关的操作 286
第19章 外源基因在原核生物中的表达 286
19.1 概述 286
19.2 实验方案 286
19.2.1 外源基因的诱导表达 286
19.2.2 大肠杆菌包含体的分离与蛋白质纯化 287
19.3 材料试剂 288
19.3.1 诱导表达材料 288
19.3.2 大肠杆菌包含体的分离与蛋白纯化材料 288
19.4 背景知识 289
19.5 关键因素及注意事项 289
19.5.1 表达前的准备要素 289
19.5.2 获得目的基因 290
19.5.3 构建重组表达载体 290
19.5.4 包含体的纯化 290
19.6 时间安排 291
参考文献 291
第20章 外源基因在真核细胞中的表达 293
20.1 真核细胞常用表达载体 293
20.1.1 pCMVp-NEO-BAN载体 293
20.1.2 pEGFP：增强型绿色荧光蛋白表达载体 293
20.1.3 pEGFT-Actin：增强型绿色荧光蛋白／人肌动蛋白表达载体 293
20.1.4 pSV2表达载体 294
20.1.5 CMV4表达载体 294
20.1.6 其他常用克隆Vector 294
20.2 外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法 294
20.2.1 磷酸钙细胞转染技术 295
20.2.2 电穿孔转染法 297
20.2.3 脂质体介导DNA转染法 300
20.2.4 病毒载体介导的基因转移 302
20.2.5 DEAE-葡聚糖法 309
参考文献 311
第21章 转基因植物 314
21.1 植物组织培养所需母液的配制 314
21.1.1 实验用具和药品 314
21.1.2 配制内容与步骤 314
21.1.3 注意事项 316
21.2 原生质体分离 316
21.2.1 仪器、材料和试剂 316
21.2.2 方法与步骤 317
21.3 植物转基因技术 317
21.3.1 植物转基因技术的基本路线 317
21.3.2 转基因的受体系统 317
21.3.3 外源基因导入植物的方法 318
21.4 转基因植物的筛选与检测 327
21.4.1 抗性基因 327
21.4.2 显色或发光报告基因 327
21.4.3 分子生物学检测方法 329
21.5 改进转基因的技术 329
21.5.1 转基因植物中外源基因的沉默 329
21.5.2 提高外源基因表达水平的策略 330
参考文献 332
第22章 转基因动物技术 333
22.1 显微注射法 333
22.1.1 实验原理 333
22.1.2 基本步骤 333
22.1.3 实验详细步骤 333
22.1.4 时间花费 342
22.1.5 关键参数及问题解决 342
22.2 胚胎干细胞方法 343
22.2.1 实验原理 343
22.2.2 ES细胞的建立与维持 343
22.2.3 ES细胞的基因组操作 344
22.2.4 转基因ES细胞的筛选——正负选择法 344
22.2.5 转基因ES细胞的检测 345
22.2.6 转基因小鼠的繁育 345
22.2.7 获得纯合的转基因鼠 345
22.2.8 本法优劣 345
22.3 反转录病毒法 346
22.3.1 反转录病毒感染法的原理 346
22.3.2 反转录病毒感染法的载体构建 346
22.3.3 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 346
22.3.4 本法优劣 347
22.4 其他方法 347
22.4.1 精子载体法 347
22.4.2 体细胞核移植法 347
22.4.3 受体介导法 348
参考文献 348
第23章 细胞凋亡的分子生物学检测方法 350
23.1 概述 350
23.2 实验方案 350
23.2.1 形态学观察 350
23.2.2 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 351
23.2.3 Caspase-3活性的检测 352
23.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 352
23.2.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法） 353
23.3 材料试剂 354
23.3.1 形态学观察 354
23.3.2 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 355
23.3.3 Caspase-3活性的检测 355
23.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 355
23.3.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法） 355
23.4 背景知识 356
23.4.1 电镜检测法 356
23.4.2 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V检测法） 356
23.4.3 Caspase-3活性的检测 357
23.4.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 357
23.4.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法） 357
23.5 关键因素及注意事项 357
23.5.1 Annexin V检测法注意事项 357
23.5.2 Caspase-3活性检测 358
23.5.3 TUNEL检测法常见问题及解决方法 358
23.6 时间安排 358
23.7 预期结果 359
参考文献 359
附录 分子生物学实验室安全及注意事项 361