分子生物学实验方法与技巧PDF电子书下载

第1章　实验前后的注意事项和行为准则 1

1.1 实验过程中的注意事项 1

1.1.1 实验前的注意事项 1

1.1.2 实验中的注意事项 4

1.1.3 实验后的注意事项 6

1.2　实验室成员的基本素质与行为准则 9

1.3　实验中的一些技巧及心得 14

1.3.1 提取高质量的RNA的技巧 14

1.3.2 细胞冻存及复苏 16

1.3.3　稳定转染后的检测方法 17

1.3.4　连接转化实验心得 17

1.3.5 Western Blot 19

参考文献 21

第一部分　DNA相关的操作 24

第2章　质粒DNA的相关实验 24

2.1 质粒DNA的分离与纯化 24

2.1.1 概述 24

2.1.2 实验材料、仪器和试剂 26

2.1.3 实验原理、操作步骤和实验要点 27

2.2 DNA酶切与电泳分析 32

2.2.1 概述 32

2.2.2 实验材料、仪器和试剂 34

2.2.3 实验原理、操作步骤和实验要点 34

2.3　重组质粒的连接、转化及筛选 37

2.3.1 概述 37

2.3.2 实验材料、仪器和试剂 40

2.3.3 实验原理、操作步骤和实验要点 41

参考文献 45

第3章　聚合酶链式反应 47

3.1 标准PCR反应和扩增产物克隆 47

3.1.1 概述 47

3.1.2 实验材料、仪器和试剂 52

3.1.3 实验原理、操作步骤和实验要点 52

3.2 反转录PCR(RT-PCR) 57

3.2.1　概述 57

3.2.2 实验材料、仪器和试剂 58

3.2.3 实验原理、操作步骤和实验要点 58

3.3 出错PCR（致突变PCR） 63

3.3.1 概述 63

3.3.2 实验材料、仪器和试剂 64

3.3.3 实验原理、操作步骤和实验要点 65

3.4 基于重叠延伸PCR的DNA合成技术 70

3.4.1 概述 70

3.4.2 实验材料、仪器和试剂 71

3.4.3 实验原理、操作步骤和实验要点 72

参考文献 74

第4章　限制性内切酶的特性及应用 77

4.1 概述 77

4.2　实验方案 77

4.2.1 单限制性内切酶对单DNA样品的消化 77

4.2.2 消化多个DNA样品 78

4.2.3 多限制性内切酶消化DNA样品 78

4.2.4 限制性内切酶对DNA的部分消化 78

4.2.5 DNA的甲基化 79

4.3　相关知识 80

4.3.1 背景知识 80

4.3.2　关键因素 81

4.3.3 时间安排 83

4.3.4　预期结果 83

参考文献 83

第5章　基因组DNA的提取 85

5.1 动物组织基因组DNA的提取 85

5.1.1 概述 85

5.1.2 实验材料 85

5.1.3 实验步骤 85

5.1.4　关键因素 86

5.1.5 常见问题 86

5.1.6 所需时间 86

5.1.7　本节溶液配制 87

5.2　植物组织基因组DNA的提取 87

5.2.1 基本方案——氯化铯离心法 87

5.2.2 备选方案——CTAB法 88

5.3 人白细胞DNA的提取 90

5.3.1 概述 90

5.3.2 实验材料 90

5.3.3 实验步骤 90

5.3.4　关键因素 91

5.3.5 所需时间 91

5.4　DNA琼脂糖凝胶电泳及回收 91

5.4.1 琼脂糖凝胶分离DNA 91

5.4.2 基本方案1——DNA电洗脱 92

5.4.3　基本方案2——NA-45纸电泳法 93

5.4.4　基本方案3——用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段 94

5.4.5 备选方案1——使用β-琼脂糖酶从低熔点琼脂糖中回收DNA 94

5.4.6 备选方案2——用玻璃珠法从低熔点琼脂糖中回收DNA 95

5.4.7　本节溶液配制 95

5.5　非变性聚丙烯酰胺胶电泳及DNA回收 96

5.5.1 基本方案 96

5.5.2　备选方案——通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段 98

参考文献 98

第6章　分子探针及Southern杂交 100

6.1　探针的种类及其选择 100

6.1.1　探针的概念 100

6.1.2　探针的种类及其选择 100

6.2　探针标记物的种类及其选择 104

6.2.1 核素标记物 104

6.2.2　非放射性标记物 104

6.3　探针标记方法及其选择 105

6.3.1 双链DNA探针标记方法 105

6.3.2 单链DNA探针标记方法 109

6.3.3 末端标记DNA探针 112

6.3.4　寡核苷酸探针标记方法 112

6.3.5 RNA探针 114

6.4　探针的纯化 114

6.4.1 乙醇沉淀法 114

6.4.2　Sephadex G-50柱层析法 115

6.4.3　微柱离心法 115

6.5　Southern杂交 115

6.5.1 实验原理 115

6.5.2　基因组Southern Blot步骤 116

6.5.3 背景信息 121

6.5.4　关键参数 121

6.5.5 问题解决方法 122

6.5.6　预期结果 122

6.5.7 时间控制 122

6.5.8 优化方案 123

参考文献 126

第7章　基因组DNA的突变分析 128

7.1 概述 128

7.2　实验方案 128

7.2.1 PCR产物单链构象多态分析（PCR-single-strand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP） 129

7.2.2 PCR-异源双链构象分析法（PCR-heteroduplex Analysis,PCR-HA） 130

7.2.3 PCR产物直接测序 130

7.2.4 PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP） 132

7.3 相关知识 133

7.3.1 背景知识 133

7.3.2 关键因素 135

7.3.3 时间安排 138

7.3.4　预期结果 139

参考文献 139

第二部分　RNA相关的操作 142

第8章 RNA的提取和cDNA合成 142

8.1 概述 142

8.2　组织或细胞的总RNA提取 143

8.2.1 细胞或者组织样品匀浆处理 143

8.2.2 RNA的抽提 143

8.2.3 RNA定量 144

8.2.4 RNA凝胶电泳 144

8.2.5　保温实验 144

8.2.6　材料与试剂 144

8.2.7 相关知识 145

8.3　mRNA的分离与纯化 146

8.3.1 装柱与平衡柱子 146

8.3.2 柱上吸附poly(A+)RNA 146

8.3.3 从柱中洗脱poly(A+)RNA 146

8.3.4 Oligo(dT)-纤维素再生 146

8.3.5　材料与试剂 147

8.3.6 相关知识 147

8.4 cDNA的合成 147

8.4.1 cDNA第一链的合成 147

8.4.2 cDNA第二链的合成 148

8.4.3 cDNA合成产物定量分析 149

8.4.4 cDNA合成产物电泳分析 150

8.4.5　材料与试剂 150

8.4.6　相关知识 150

参考文献 151

第9章　寻找差异表达基因方法——SSH法 154

9.1 概述 154

9.2　实验方案 155

9.2.1 RNA提取和cDNA合成 155

9.2.2　Rsa I酶切消化 155

9.2.3　寡聚核苷酸接头（Adaptor）连接 156

9.2.4 第一次消减杂交 157

9.2.5 第二次消减杂交 157

9.2.6　PCR扩增 158

9.2.7 克隆消减cDNA文库 159

9.3　材料与试剂 160

9.3.1 试剂 160

9.3.2　仪器设备 161

9.4　相关知识 161

9.4.1 背景知识 161

9.4.2 关键因素 162

9.4.3 时间安排 162

9.4.4　预期结果 162

参考文献 163

第10章　全长基因的克隆——SMART技术 165

10.1 概述 165

10.2　实验方案 166

10.2.1 第一链cDNA合成 166

10.2.2 LD PCR扩增cDNA 167

10.2.3 蛋白酶K的消化 167

10.2.4　Sfi I酶切消化 168

10.2.5 通过CHROMA SPIN-400使cDNA链分段 168

10.2.6 连接cDNA到载体中 169

10.2.7 细菌的培养 170

10.2.8 滴定未扩增的文库 170

10.2.9 测定重组率 170

10.2.10 文库扩增 171

10.2.11 滴定扩增文库 171

10.3　材料与试剂 172

10.3.1 试剂 172

10.3.2　仪器设备 172

10.4　相关知识 173

10.4.1 背景知识 173

10.4.2 关键因素 173

10.4.3 时间安排 174

10.4.4　预期结果 174

参考文献 174

第11章 Northern Blot技术 176

11.1 概述 176

11.2　实验方案 176

11.2.1 经甲醛变性处理后进行的RNA电泳 176

11.2.2 变性RNA在膜上的转移和固定 177

11.2.3　探针标记 178

11.2.4 杂交和放射自显影 178

11.3　材料与试剂 179

11.3.1 试剂 179

11.3.2　仪器设备 179

11.4　相关知识 179

11.4.1 背景知识 179

11.4.2 关键因素 180

11.4.3 时间安排 180

11.4.4　预期结果 180

参考文献 180

第12章　siRNA的应用 182

12.1 概述 182

12.2　实验方案 183

12.2.1 siRNA设计 183

12.2.2　转录模板制备 184

12.2.3 dsRNA合成 184

12.2.4 siRNA制备和纯化 184

12.3　材料与试剂 185

12.3.1 试剂 185

12.3.2　仪器设备 185

12.4　相关知识 185

12.4.1 背景知识 185

12.4.2 关键因素 186

12.4.3 时间安排 186

12.4.4　预期结果 186

参考文献 186

第13章　RNA酶保护实验 188

13.1 概述 188

13.2　实验方案 188

13.2.1 制备标记的单链反义RNA探针 188

13.2.2 RNA杂交 189

13.2.3 RNA酶消化 189

13.2.4　凝胶电泳和放射自显影 189

13.3　材料与试剂 190

13.3.1 试剂 190

13.3.2　仪器设备 190

13.4　相关知识 190

13.4.1　背景知识 190

13.4.2　关键因素 191

13.4.3 时间安排 191

13.4.4　预期结果 191

参考文献 192

第三部分　蛋白质相关的操作 196

第14章　蛋白质分离、鉴定相关技术 196

14.1 蛋白的双向电泳 196

14.1.1 样品的准备 196

14.1.2 电泳 199

14.1.3 蛋白的检测 203

14.1.4 问题解决及关键因素 205

14.1.5 时间花费 207

14.1.6 背景信息 208

14.2 酶联免疫吸附测定法（ELISA） 208

14.2.1 实验原理 208

14.2.2　材料与试剂 210

14.2.3 背景知识 211

14.2.4 影响因素 211

14.2.5 问题解决 212

14.2.6 时间安排 213

14.2.7 预期结果 213

14.3　Western印迹法 214

14.3.1 实验原理 214

14.3.2　材料、试剂和仪器 215

14.3.3　试剂的配制方法 215

14.3.4　方法与步骤 217

14.3.5 背景信息 221

14.3.6 问题解决 221

14.3.7　关键因素 222

14.3.8 时间花费 224

参考文献 224

第15章　染色质免疫沉淀技术（ChIP） 229

15.1 概述 229

15.2　实验方案 231

15.2.1 甲醛交联细胞 231

15.2.2 染色质超声断裂 231

15.2.3 免疫沉淀蛋白和DNA复合物 231

15.2.4 收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA） 232

15.2.5　洗脱免疫复合物 232

15.2.6　去除甲醛交联 232

15.2.7 DNA纯化 232

15.2.8 染色质免疫沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定 233

15.3　材料试剂 233

15.3.1 试剂 233

15.3.2　仪器设备 234

15.4　相关知识 234

15.4.1 背景知识 234

15.4.2　关键因素 235

15.4.3 时间安排 235

15.4.4　预期结果 235

参考文献 235

第16章　蛋白复合体的分离与鉴定 238

16.1 Yoshihiro Nakatani的研究方法（Sasaki,Mello et al.,2009） 239

16.1.1 稳定表达目的蛋白的载体系统 239

16.1.2　逆转录病毒载体转染包装细胞 240

16.1.3　逆转录病毒的转导 241

16.1.4　转导阳性细胞的分选 242

16.1.5 带有表位标签外源蛋白表达的检测 243

16.1.6　细胞的大规模培养 244

16.1.7 细胞不同组分的分离 245

16.2　分离蛋白复合体的具体操作 247

16.2.1 MAML1内源性蛋白复合体的分离 247

16.2.2 免疫亲和纯化MAML1蛋白复合体的实验操作 250

16.2.3 其他蛋白复合体的实验操作 255

16.2.4　后续实验操作的具体实验方案 260

参考文献 262

第17章　免疫沉淀 266

17.1 实验原理 266

17.2　仪器、材料和试剂 267

17.2.1 裂解缓冲液 267

17.2.2　其他试剂 267

17.2.3　仪器和材料 268

17.3　方法与步骤 268

17.3.1 裂解产物的准备 268

17.3.2　裂解液的预处理 269

17.3.3　免疫沉淀 269

17.4　背景知识 270

17.5　关键参数 270

17.5.1　抗原的提取 270

17.5.2　抗体的产量 270

17.5.3 多抗单抗的选择 271

17.5.4　抗体滴度 271

17.5.5　免疫吸附剂 271

17.5.6 非特异性对照的设立 271

17.5.7 洗涤 271

17.6　问题解决 272

17.6.1 非特异性条带 272

17.6.2 分离胶高背景 272

17.6.3　轻链重链显示 272

17.7　预期结果 272

17.8 时间花费 272

17.9　注意事项 273

17.9.1　抗体的性质 273

17.9.2　缓冲液的性质 273

17.9.3 防止蛋白变化 273

17.9.4　抗体／缓冲液的比例 273

17.10　抗体与Beads配对表 273

参考文献 274

第18章　免疫荧光染色技术 276

18.1 概述 276

18.2　实验原理 276

18.3　仪器、材料和试剂 276

18.4　方法与步骤 277

18.4.1 制片 277

18.4.2 固定 277

18.4.3 水洗 277

18.4.4 染色 278

18.5　预期结果 278

18.6　背景知识 278

18.7　关键参数 279

18.8　问题解决 279

18.9　时间花费 279

18.10　标本保存 280

18.11 注意事项 280

18.12　非特异性染色的消除方法 280

18.12.1 主要原因 280

18.12.2 消除方法 280

18.13　常用固定方法与试剂 283

参考文献 283

第四部分　细胞生物学相关的操作 286

第19章　外源基因在原核生物中的表达 286

19.1　概述 286

19.2　实验方案 286

19.2.1 外源基因的诱导表达 286

19.2.2 大肠杆菌包含体的分离与蛋白质纯化 287

19.3　材料试剂 288

19.3.1　诱导表达材料 288

19.3.2 大肠杆菌包含体的分离与蛋白纯化材料 288

19.4　背景知识 289

19.5　关键因素及注意事项 289

19.5.1　表达前的准备要素 289

19.5.2　获得目的基因 290

19.5.3　构建重组表达载体 290

19.5.4 包含体的纯化 290

19.6　时间安排 291

参考文献 291

第20章　外源基因在真核细胞中的表达 293

20.1 真核细胞常用表达载体 293

20.1.1 pCMVp-NEO-BAN载体 293

20.1.2　pEGFP：增强型绿色荧光蛋白表达载体 293

20.1.3 pEGFT-Actin：增强型绿色荧光蛋白／人肌动蛋白表达载体 293

20.1.4　pSV2表达载体 294

20.1.5 CMV4表达载体 294

20.1.6　其他常用克隆Vector 294

20.2　外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法 294

20.2.1 磷酸钙细胞转染技术 295

20.2.2 电穿孔转染法 297

20.2.3 脂质体介导DNA转染法 300

20.2.4　病毒载体介导的基因转移 302

20.2.5 DEAE-葡聚糖法 309

参考文献 311

第21章　转基因植物 314

21.1 植物组织培养所需母液的配制 314

21.1.1 实验用具和药品 314

21.1.2 配制内容与步骤 314

21.1.3 注意事项 316

21.2　原生质体分离 316

21.2.1 仪器、材料和试剂 316

21.2.2　方法与步骤 317

21.3　植物转基因技术 317

21.3.1 植物转基因技术的基本路线 317

21.3.2　转基因的受体系统 317

21.3.3 外源基因导入植物的方法 318

21.4　转基因植物的筛选与检测 327

21.4.1 抗性基因 327

21.4.2　显色或发光报告基因 327

21.4.3　分子生物学检测方法 329

21.5　改进转基因的技术 329

21.5.1 转基因植物中外源基因的沉默 329

21.5.2　提高外源基因表达水平的策略 330

参考文献 332

第22章　转基因动物技术 333

22.1　显微注射法 333

22.1.1 实验原理 333

22.1.2　基本步骤 333

22.1.3 　实验详细步骤 333

22.1.4 时间花费 342

22.1.5 关键参数及问题解决 342

22.2　胚胎干细胞方法 343

22.2.1 实验原理 343

22.2.2　ES细胞的建立与维持 343

22.2.3　ES细胞的基因组操作 344

22.2.4　转基因ES细胞的筛选——正负选择法 344

22.2.5 转基因ES细胞的检测 345

22.2.6　转基因小鼠的繁育 345

22.2.7　获得纯合的转基因鼠 345

22.2.8　本法优劣 345

22.3　反转录病毒法 346

22.3.1 反转录病毒感染法的原理 346

22.3.2　反转录病毒感染法的载体构建 346

22.3.3 通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞 346

22.3.4　本法优劣 347

22.4　其他方法 347

22.4.1　精子载体法 347

22.4.2　体细胞核移植法 347

22.4.3　受体介导法 348

参考文献 348

第23章　细胞凋亡的分子生物学检测方法 350

23.1 概述 350

23.2　实验方案 350

23.2.1 形态学观察 350

23.2.2　磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 351

23.2.3 Caspase-3活性的检测 352

23.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 352

23.2.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法） 353

23.3　材料试剂 354

23.3.1 形态学观察 354

23.3.2　磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 355

23.3.3 Caspase-3活性的检测 355

23.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 355

23.3.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法） 355

23.4　背景知识 356

23.4.1 电镜检测法 356

23.4.2　磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V检测法） 356

23.4.3 Caspase-3活性的检测 357

23.4.4 DNA琼脂糖凝胶电泳检测法 357

23.4.5 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记检测法（TUNEL检测法） 357

23.5　关键因素及注意事项 357

23.5.1 Annexin V检测法注意事项 357

23.5.2　Caspase-3活性检测 358

23.5.3 TUNEL检测法常见问题及解决方法 358

23.6　时间安排 358

23.7　预期结果 359

参考文献 359

附录　分子生物学实验室安全及注意事项 361