第一章 绪论 4
1.1 tPA的研究进展 4
1.1.1 tPA发展简史 4
1.1.2 tPA的生物学活性 5
1.1.3 tPA的功能及应用 6
1.2 产蛋鸡卵黄中营养物的转运与沉积的研究 8
1.2.1 apo-B100对VLDLy组装过程的影响 8
1.2.2 VLDLy在卵黄中沉积的过程 9
1.3 绿色荧光蛋白的研究进展 11
1.3.1 绿色荧光蛋白的特点 11
1.3.2 绿色荧光蛋白的应用 12
1.4 减毒沙门氏菌载体系统 15
1.4.1 沙门氏菌的侵入途径 15
1.4.2 减毒沙门氏菌的研究 16
1.4.3 减毒沙门氏菌作为载体的研究 17
1.5 转基因家禽生物反应器的研究进展 20
1.5.1 转基因动物作为生物反应器 20
1.5.2 家禽作为生物反应器的独特优势 21
1.5.3 家禽转基因技术面临的困境 21
1.5.4 常规转基因动物技术在家禽转基因应用中的局限性 23
1.6 利用转基因动物生物反应器生产tPA 25
1.6.1 tPA在原核和真核细胞中的表达 25
1.6.2 tPA在转基因动物乳腺中的表达 25
1.6.3 tPA的纯化和检测 26
1.7 问题与展望 28
参考文献 29
第二章 pCDNA3-apo-△tPA特异性表达载体的构建 38
2.1 材料与方法 38
2.1.1 主要试剂 38
2.1.2 主要溶液及配制方法 38
2.1.3 主要仪器设备 40
2.1.4 DNA分析软件 40
2.2 试验方法 41
2.2.1 试验设计 41
2.2.2 引物设计与合成 42
2.2.3 对apo-B100和△tPA目的基因分别进行扩增、回收纯化、克隆 43
2.2.4 连接产物的转化、质粒提取、酶切鉴定 46
2.2.5 apo-△tPA基因融合与pCDNA3-apo-△tPA载体构建 50
2.3 结果与分析 51
2.3.1 目的基因的克隆和重组质粒的酶切鉴定 51
2.3.2 pMD18-T-apo-△tPA和pMD18-T-△tPA质粒的酶切鉴定 51
2.3.3 pMD18-T-apo-△tPA和pMD18-T-△tPA质粒的酶切鉴定 52
2.4 讨论 53
参考文献 55
第三章 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）的构建 55
3.1 材料 60
3.1.1 主要试剂与实验动物 60
3.1.2 主要溶液及配制方法 60
3.1.3 主要仪器设备 62
3.1.4 DNA分析软件 62
3.2 试验方法 63
3.2.1 基础载体和克隆载体 63
3.2.2 构建pMD18-T-apo-tPA载体 64
3.2.3 引物设计与合成 64
3.2.4 apo-tPA基因的扩增、回收纯化、克隆 64
3.2.5 连接产物的转化、质粒提取及鉴定 66
3.2.6 apo-tPA融合基因与pEGFP-N1-apo-tPA表达载体构建 69
3.2.7 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）的构建 69
3.3 结果与分析 71
3.3.1 目的基因的克隆 71
3.3.2 pMD18-T-apo-tPA质粒的PCR鉴定和酶切鉴定 71
3.3.3 pEGFP-N1-apo-tPA质粒的PCR鉴定和酶切鉴定 72
3.3.4 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）鉴定 73
3.4 讨论 74
3.5 小结 79
参考文献 80
第四章 减毒鼠伤寒沙门氏菌△crp SL1344作为载体的研究 84
4.1 材料与试剂 84
4.1.1 材料 84
4.1.2 主要培养基及抗生素的配制 84
4.2 试验方法 86
4.2.1 重组减毒沙门氏菌的稳定性 86
4.2.2 重组菌的转染 86
4.2.3 重组减毒沙门氏菌分布检测 86
4.2.4 减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体的研究 87
4.3 结果与分析 88
4.3.1 重组减毒沙门氏菌的稳定性 88
4.3.2 重组减毒沙门氏菌分布检测 88
4.3.3 减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体的研究 89
4.4 讨论 91
4.5 小结 93
参考文献 94
第五章 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）在鸡胚成纤维细胞的表达检测 94
5.1 材料 98
5.1.1 试验材料 98
5.1.2 主要试剂 98
5.2 试验方法 102
5.2.1 鸡胚成纤维细胞的分离和体外培养 102
5.2.2 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）感染鸡胚成纤维细胞 103
5.2.3 鸡胚成纤维细胞中表达产物的定性检测 103
5.2.4 鸡胚成纤维细胞中表达产物的ELISA检测 104
5.2.5 鸡胚成纤维细胞中表达产物的体外活性检测 105
5.3 结果与分析 106
5.3.1 鸡胚成纤维细胞的体外培养 106
5.3.2 表达产物的SDS-PAGE电泳检测 107
5.3.3 表达产物的荧光显微镜检测 107
5.3.4 表达产物的ELISA检测 107
5.3.5 表达产物的活性检测 108
5.4 讨论 109
5.5 小结 112
参考文献 113
第六章 重组菌△crp SL1344（pEGFP-N1-apo-tPA）在鸡体内表达及卵黄中沉积 113
6.1 试验方法 119
6.1.1 材料 119
6.1.2 主要器械及仪器 119
6.1.3 主要溶液及配制方法 119
6.2 试验方法 121
6.2.1 采用减毒鼠伤寒沙门氏菌介导法 121
6.2.2 融合蛋白在鸡蛋中的定性表达检测 121
6.2.3 融合蛋白在鸡蛋中的定量检测 122
6.2.4 融合蛋白在卵黄中的活性表达检测 123
6.3 结果分析 124
6.3.1 卵黄中融合蛋白的SDS电泳及其荧光镜检 124
6.3.2 apo-tPA-GFP融合蛋白在卵黄表达含量的检测 125
6.3.3 融合蛋白在卵黄中的活性表达检测 126
6.4 讨论 127
6.5 小结 134
参考文献 135
第七章 展望 142
参考文献 142
附录 147
附录一 英文缩写词表 147
附录二 pMD 18-T Vector碱基序列 149
附录三 pcDNA3.1 （-）碱基序列 152
附录四 pEGFP-N1载体序列 157
附录五 tPA碱基序列 161
附录六 tPA氨基酸序列 164
附录七 apo碱基序列 165
附录八 apo氨基酸序列 175
后记 179